第7章微生物的遗传变异和育种

第七章微生物的遗传变异和育种第一节遗传变异的物质基础一、3个经典实验（一）经典转化实验（二）噬菌体感染实验（三）植物病毒的重建实验二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式（一）7个水平1.细胞水平在不同种微生物或同种微生物的不同细胞中，细胞核的数目通常有所不同。2.细胞核水平除核基因组外，在真核生物和原核生物的细胞质（酵母菌2微米质粒例外地在核内）中，多数还存在核外染色体。3.染色体水平（1）染色体数（2）染色体倍数指同一细胞中相同染色体的套数。在原核生物中，通过转化、转导或接合等过程而获得外源染色体片段时，只能形成一种不稳定的、称作部分双倍体的细胞。4.核酸水平遗传物质类型核外染色体真核细胞质基因，叶绿体、线粒体等共生生物微米质粒原核F因子R因子Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒核基因组（1）核酸种类（2）核酸结构（3）DNA长度5.基因水平原核生物的基因调控系统如下：基因及其表达产物的名称书写标准：绝大多数微生物DNA为双链多数真菌病毒：双链RNA多数RNA噬菌体：单链RNA环状双链DNA：原核生物和部分病毒部分病毒线状双链DNA超螺旋状双链DNA：细菌质粒DNA少数病毒的DNA为单链基因调控系统操纵子启动基因操纵基因结构基因调节基因基因名称3个小写英文字母表示，且应排成斜体，书写时可在其下划一底线，若同一基因有不同位点，可在基因符号后加一正体大写字母或数字，如lzcZ等蛋白质名称3个大写英文字母或1个大写、2个小写表示，必须用正体字抗性基因R大写注在基因符号的右上角6.密码子水平7.核苷酸水平（二）原核生物的质粒1.定义和特点2.质粒在基因工程中的应用3.质粒的分离与鉴定4.质粒的种类5.典型质粒简介（1）F质粒又称F因子、致育因子或性因子，是细菌决定性别并有转移能力的质粒。其上有转座因子的存在，可以整合到宿主核基因染色体上的一定部位，并导致各种Hfr菌株的产生。（2）R质粒又称R因子或抗性因子一般是由两个相连的DNA片段组成，其一称抗性转移因子/RTF，具有转移功能，其二为抗性决定因子/r因子，含各种抗性基因。（3）Col质粒最低突变单位或交换单位：核苷酸单位信息单位：密码子遗传的功能单位：基因麻花状的超螺旋结构和核染色体复制同步的严紧型复制控制；不同步的松弛型复制控制质粒还有重组的功能F因子等质粒可以与核染色体发生整合，这类质粒称为附加体又称大肠杆菌素质粒或产大肠杆菌素因子。许多细菌都能产生抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株的代谢产物——细菌素。凡带Col质粒的菌株，因质粒本身可编码一免疫蛋白，故对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。（4）Ti质粒植物基因工程中使用广泛。（5）Ri质粒（6）mega质粒即巨大质粒（7）降解性质粒（8）生理功能性质粒第二节基因突变和诱变育种一、基因突变（一）突变类型1.营养缺陷型2.抗性突变型3.条件致死突变型Ts突变株即温度敏感突变株：突变株使某些重要蛋白质的结构和功能发生改变，以致会在某特定温度下具有功能，而在另一温度下则无功能。4.形态突变型5.抗原突变型包括细胞壁缺陷变异（L型细菌等）、荚膜或鞭毛成分变异等，一般也属非选择性突变。6.产量突变型产量变高的正突变；变低负突变。（二）突变率（三）基因突变的特点（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明1.Luria等的变量实验2.Newcombe的涂布实验3.Lederberg等的影印平板实验通过影印接种法，可从非选择性条件下生长的微生物群体中，分离到过去只有在选择性条件下才能分离到的相应突变株。（五）基因突变及其机制突变株的表型选择性突变株营养缺陷型抗性突变型条件致死突变型非选择性突变株形态突变型抗原突变型产量突变型1.诱发突变（1）碱基的置换①直接引起置换的诱变剂②间接引起置换的诱变剂（2）移码突变（3）染色体畸变2.自发突变（六）紫外线对DNA损伤及其修复嘧啶对UV的敏感性比嘌呤强得多，其光化学反应产物主要是嘧啶二聚体和水合物，相邻嘧啶形成二聚体后，造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。微生物具有多种修复受损DNA的作用。1.光复活作用经UV照射后带有嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种光激活酶——光解酶结合，这种复合物在300-500nm可见光下时，其中的酶会因获得光能而激活，并使二聚体重新分解成单体。2.切除修复二、突变与育种（一）自发突变与育种1.从生产中育种2.定向培育优良菌株定向培育:利用微生物的自发突变率,并采用特定的选择条件,通过对微生物群体不断移植以选育优良菌株的古老方法。（二）诱变育种1.诱变育种的基本环节碱基置换•转换：嘌呤换嘌呤；嘧啶换嘧啶•颠换：嘌呤换嘧啶；嘧啶换嘌呤内切核酸酶在二聚体的5’一侧切开一个3’-OH和5’-P的单链缺口外切核酸酶切除二聚体，扩大缺口DNA聚合酶重新合成缺失的DNA链DNA连接酶，修复2.诱变育种中的几个原则艾姆斯实验处理单细胞或单孢子悬液的两个原因——造成不纯菌落的存在：剂量存活率曲线和剂量诱变率曲线3.3类突变株的筛选方法（1）产量突变株的筛选（2）抗药性突变株的筛选梯度平板法：是一种含有某药物的梯度浓度的琼脂培养基平板，它由含药物的上半个斜面和不含药物的下半个斜面分两次浇合而成。（3）营养缺陷型菌株的筛选①与筛选营养缺陷型菌株有关的3类培养基选择简便有效的诱变剂挑选优良的出发菌株处理单细胞或单孢子悬液选用最适的诱变剂量充分利用复合处理的协同效应利用和创造形态、生理和产量间的相关指标设计高效筛选方案基本培养基：MM仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基完全培养基:CM满足某微生物一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基补充培养基：SM只能满足相应的营养缺陷型突变株生长所需要的组合或半组合培养基，是在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢物所组成②与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体③营养缺陷型的筛选方法分为诱变、淘汰野生型、检出和坚定四个环节第三节基因重组和杂交育种一、原核生物的基因重组原核基因重组的特点：片段性；单向性；多样性。（一）转化1.定义：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子。2.转化微生物的种类在实验室中常用的一些属于肠道菌科的细菌如大肠杆菌等很难进行转化，为克服这一不利条件，可选用有利于DNA透过细胞膜的氯化钙处理大肠杆菌的球状体，使之发生低频率的转化。有些真菌在制成原生质体后，也可实现转化。3.感受态凡能发生转化，其受体细胞必须处于感受态。感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。调节感受态的一类特异蛋白称感受态因子：4.转化因子野生型从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株，应能在其相应的基本培养基上生长营养缺陷型经诱变处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基上才能生长原养型一般指营养缺陷菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同诱变剂处理抗生素法或菌丝过滤法淘汰野生型检出缺陷型：一个培养皿（夹层和限量补充培养）；两个培养皿（逐个检出和影印接种法）坚定缺陷型：生长谱法感受态因子膜相关的DNA结合蛋白细胞壁自溶素几种核酸酶转化因子的本质是离体的DNA片段。5.转化过程6.转染指用提纯的病毒核酸去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。转染和转化的区别十分明显，因为作为转染的病毒核酸，绝不是作为供体基因的功能，被感染的宿主也绝不是能形成转化子的受体菌。（二）转导通过缺陷噬菌体的媒介,把供体细胞中的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。由转导作用而获得部分新性状的重组细胞，称为转导子。1.普遍转导指通过极少数完全缺陷的噬菌体对供体菌基因上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。（1）完全普遍转导外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，再通过双交换而整合到染色体组上，使后者成为一个遗传性状稳定的重组体，称作普遍转导子。（2）流产普遍转导经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如果这段外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅表现稳定的转录、翻译和性状表达，这一现象就称为流产转导。2.局限转导指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组、形成局限转导子的现象。细胞分裂后，形成一个转化子和一个仍保持受体菌原来基因型的子代受体菌染色体组进行复制，于是杂合区也跟着得到复制来自供体菌的ssDNA片段被细胞内的感受态特异的ssDNA结合蛋白相结合，并使ssDNA进入细胞，随即在RecA蛋白的介导下与受体菌核染色体上的同源区段配对、重组，形成一小段杂合DNA区段供体菌的dsDNA片段与感受态受体菌细胞表面的膜连DNA结合蛋白结合，期中一条链被核酸酶切开和水解，另一条进入细胞（1）低频转导（LFT）（2）高频转导（HFT）双重溶源菌3.溶源转变当正常的温和噬菌体感染其宿主细胞而使其发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫性外的新遗传性状的现象，称溶源转变。溶源转变不同于上述的局限转导：（三）接合1.定义：供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合。接合子2．能进行接合的微生物种类E．coli中决定性别的是其中的F质粒，它是一种属于附加体性质的质粒，既可在细胞内独立存在，也可整合到核染色体组上；可经过接合而获得，也可通过吖啶类化合物、溴化乙锭或丝裂霉素等处理而从细胞中消除。3.E．coli的四种接合型菌株（1）F+菌株（2）F_菌株（3）Hfr菌株（高频重组菌株）部分合子接合中断法（4）F’菌株部分双倍体F质粒转导或F因子转导、性导或F质粒媒介的转导（四）原生质体融合只局限于供体菌核染色体部分缺陷的温和噬菌体误切或双重溶源菌的裂解而形成UV等因素对溶源菌的诱导是一种不携带任何外源基因的正常噬菌体噬菌体基因而不是供体菌基因提供了宿主的新性状新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗传重组形成的稳定转导子获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失二、真核微生物的基因重组（一）有性杂交不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组（二）准性杂交1.定义：一种类似于有性生殖，但比它更为原始的两性生殖方式，这是一种在同种而不同菌株的体细胞之间发生的融合，它可不借减数分裂而导致低频基因重组并产生重组子。2.准性生殖过程单倍体杂合子3.准性杂交育种第四节基因工程一、基因工程的定义基因重组二、基因工程基本操作（一）目的基因的取得（二）优良载体的选择（三）目的基因与载体DNA的体外重组（四）重组载体导入受体细胞（五）重组受体细胞的筛选和鉴定（六）“工程菌”或“工程细胞”的大规模培养三、基因工程应用第五节菌种的衰退、复壮和保藏一、菌种的衰退、复壮（一）衰退的防止1.控制传代次数2.创造良好的培养条件3.利用不易衰退的细胞传代4.采用有效的菌种保藏方法（二）菌种的复壮1.纯种分离法2.通过宿主体内复壮3.淘汰已衰退的个体二、菌种的保藏（1）冷冻干燥保藏法（2）液氮超低温保藏法选择亲本强制异合移单菌落验稳定性促进变异选出良种