第8章(201309)

1第8章神经干细胞的诱导分化孙晓谦赵明光第一节概述目前，神经干细胞（neuralstemcells,NSCs）的分离和体外培养已经取得可喜的进展，但无论是体外还是体内研究的结果，NSCs分化为神经元的比例都明显低于胶质细胞，致使难以达到理想的替代因损伤和发育缺陷等原因造成的神经元缺失的目的。究其主要原因是目前对NSCs分化的机制还不十分清楚，因此不能对各类神经系统疾病的治疗做到有的放矢。细胞分化首先是基因选择性地表达各自特有的专一性蛋白质，而最终导致细胞形态、结构与功能的差异。在脑的发育过程中，NSCs增殖、迁移和分化为特定的细胞系（见图8-1）。目前已经明确成体中枢神经系统中存有NSCs，其向神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞等神经胶质谱系分化是由特定的信号级联决定的。这种信号级联调节不同转录因子的活化，且有多种细胞因子和化学物质参与调节NSCs增殖、迁移和分化。NSCs的分化，可能存在细胞自身基因调控和外来信号调控两种机制。许多转录因子参与细胞基因的调控，转录因子在特定时间通过某一途径被启动后，引起或关闭下游基因的表达，决定着NSCs的分化命运。同时，同一来源的NSCs移植到不同部位后，其分化结果也不相同，但往往与接受移植部位的细胞相似，提示外来信号调控作用的重要性。充分了解NSCs的分化调控机制，对于其在神经科学方面的应用尤为重要。2图8-1干细胞的分化第二节神经的诱导作用1924年，Mangold和Spemann在两栖类动物体内，从原本属于原肠胚的组织中切取少量细胞移植到受体胚胎的腹侧区。令人惊讶的是，移植物在该位置上存活并生长，并发育出一段神经管和一个轴向中胚层，即脊髓和体节。后期通过对不同类型移植物进行相应的染色可以鉴别出相应的受体细胞，因此推断，被移植的细胞不会自发形成神经外胚层，而是形成背侧的中胚层。“组织者”借助诱导因子以信号连接的方式使相邻的宿主组织生成子代神经组织，神经诱导现象由此发现。移植后的神经诱导是由背侧中胚层对分泌因子进行应答反应所形成，该分泌因子源自信号中心。经推测是一个叫做背侧内胚层的临近位置，在两栖类动物中被称为Nieuwkoop中心。在非洲爪蟾属类生物中，Nieuwkoop中心形成于VegT、Vg1和节点相关蛋白及β-连环蛋白的表达。Spemann和Mangold的实验可以预测到，神经诱导物质来自“组织者”。虽然一些研究试图找出这些神经诱导物质，但最近的工作仅仅得出这样一种假设：○1表皮的形成需要短距离的细胞间的信号转导；○2这类信号的缺失，引发神经3组织的形成。然而，能与这些信号相互干扰的物质均为TGF-β家族的一员，例如TGF-β、节点相关蛋白和骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticproteins，BMPs）。随后，相类似的神经诱导现象又在斑马鱼、鸡和小鼠等生物胚胎中被发现。研究表明，神经诱导是一个脊椎动物在神经系统发生发展中尤为关键的一步。鉴于这一里程碑式的发现，人们意识到诱导因子在脊椎动物胚胎的神经组织发生发育中起具有关键性的诱导作用，随后大量的研究工作集中在了解相关诱导因子的功能与类型。此外，许多参与表达启动神经诱导信号的转录因子也逐渐被识别出来。在胚胎中，这些因素相互协调诱导神经平稳发展。第三节神经干细胞诱导分化的有关因素目前对NSCs的分离、培养和纯化等已有较成熟的技术，而对于NSCs的定向诱导分化，虽已知有多种细胞因子参与其中，但仍缺乏精确的调控方法。现在得到的共识是，NSCs的增殖或定向分化是由其自身基因信号活化和局部微环境共同调节的，二者互相作用，彼此补充，共同作用于NSCs。一、基因调控基因调控是指NSCs自身的转录因子及其他功能蛋白对其发育的调控。许多转录因子参与了NSCs的增殖和分化过程。基因调控对NSCs的增殖和分化至关重要，特别是不同的发育分化阶段主要调控基因决定着NSCs向所需功能的神经细胞分化。基因的表达受到其自身固有分子程序的调控和周围环境的影响，其研究途径主要有体外与体内两种。体外研究主要是在各种外环境条件诱导刺激下，研究基因对NSCs增殖和分化的影响。体内研究主要通过基因转导与基因敲除，检测基因在NSCs分化方向上的作用。4（一）碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)其编码的bHLH蛋白在N端近60个氨基酸的片段内具有特征序列模式：helix-1oop-helix模体，及其上游短的富含碱性氨基酸顺序。bHLH基因是决定神经细胞分化命运的功能基因。在bHLH基因家族中，Ngn1、Ngn2和Mash1在神经细胞谱系的决定中具有重要作用。在发育的哺乳动物大脑中，Ngnl和Ngn2仅在神经发生时期脑室区神经上皮前体细胞中表达，两者均与普遍存在的bHLH蛋白形成二聚体，后者通过碱性区域与带负电荷的DNA序列结合，从而启动组织特异基因表达，促使干细胞向神经元方向分化。（二）核受体辅助抑制因子(nuclearreceptorco-repressor，N-CoR)作为转录抑制因子，其阻止NSCs向胶质细胞分化，但通过拮抗酶的活性进行调节。N-CoR基因突变大鼠的胚胎干细胞对成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体（fibroblastgrowthfactorreceptor2，FGF2）的增殖反应降低，可分化成星形胶质样细胞。（三）Inscntesble这是调节不对称分裂过程的重要基因，其产物Insc蛋白在细胞内呈不对称分布，集中位于发育胚胎顶部细胞的表面。细胞不对称分裂后，一个含有Insc蛋白的子代细胞具有干细胞特性，而另一个不含Insc蛋白的子代细胞进行分化。Insc蛋白的功能还涉及其他调节蛋白Notch、Numb和Prospero的不对称分布。（四）ATP结合盒转运子（ATP-bindingcassettetransporters，ABC转运子）参与物质跨膜转运的膜蛋白，与肿瘤耐药机制有关。乳腺癌耐药蛋白（breastcancerresistanceprotein，BCRP)是ABC转运子超家族成员。对NSCs和已经分化的神经细胞的基因进行的分析发现，BCRP在NSCs或神经前体细胞中表达丰富，有学者认为，BCRP可能是NSCs和造血干细胞的特异性标记物，其调节功能值得进一步研究。（五）孤儿核受体（murrl）其参与NSCs向多巴胺能神经元方向的定向分化，机制为在Nurrl活化后，与位于酪氨酸羟化酶基因启动子区的反应元件相结合，引起相关基因的表达。（六）musashil5这是1种RNA结合蛋白，在成年脑的星形细胞、室管膜细胞和NSCs中有较高地表达。它可以通过很高的亲和力优先结合1个特殊的RNA序列。研究发现，通过减少Musashil的活性可降低NSCs自我更新和形成神经球的能力。这些表明，Musashil可以诱导NSCs的自我更新和存活。（七）Notch基因Notch基因编码一个跨膜受体，与bHLH信号作用相反，Notch蛋白的作用为抑制干细胞向神经元方向分化，并促进向胶质细胞方向分化，是神经胶质发生的重要诱导剂。（八）NZF基因家族在哺乳动物神经分化期间，NZF-1、NZF-2和NZF-3短暂表达。通过维甲酸(Retinoicacid，RA)处理诱导神经元后，NZF基因家族的表达水平增加，在神经元分化中起重要作用。（九）PTEN基因PTEN是最初发现于胶质母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和肾癌中的一种丢失频率较高的肿瘤抑制基因，其丢失可导致多种人类肿瘤的发生。近年来发现，PTEN与中枢神经系统发育密切相关。PTEN的表达在大鼠的发育过程中普遍存在，而PTEN突变常导致中枢神经系统发育障碍。二、外源性信号的调控外源性信号调控是指NSCs所处的周围环境对其发育过程的调控，这对NSCs的发育同样重要。同一来源NSCs在不同微环境中可发育为不同的神经细胞，甚至发生横向分化，且干细胞所处的微环境也随着时间、空间变化时刻在发生变化。外源性信号包括细胞因子、化学物质和微环境3方面，其中细胞因子主要包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素以及神经细胞黏附因子等，它们均参与NSCs的诱导分化。化学物质主要包括一氧化氮等。微环境是指能对NSCs分化产生影响的周围结构成分，主要包括包括附近的神经细胞、胶质细胞和细胞外基质等。6（一）细胞因子1．表皮生长因子（epidermalgrowthfactor,EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）这两种因子均可以维持NSCs的自我更新能力，但两种生长因子对NSCs促增殖作用的时间不同。bFGF2在NSCs增殖的早期阶段发挥促有丝分裂的作用，使NSCs获得对另一作用更强的促有丝分裂因子EGF的反应性；而EGF在NSCs增殖后期发挥作用。bFGF和EGF对NSCs分化方向的作用也不相同，bFGF2能增加干细胞向神经元分化的比例，而表达EGF的干细胞生成的神经元常少于1％，绝大多数是星形胶质细胞，且这两种生长因子作用的NSCs分化形成的神经元多为GABA能神经元。2．脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)和胰岛素样生长因子（insulingrowthfactor,IGF）两种因子可以增加EGF依赖性的黑质前体细胞分化成为神经元的数量。另外，BDNF可使NSCs分化为GABA能神经元的比例达70％。3.血小板源性生长因子（plateletderivedgrowthfactor,PDGF)这是干细胞分化早期的分裂原，它能增加不成熟神经元的形成数量，对神经元的形成起一定的作用。在去除PDGF时，NSCs可分化为神经元、星形胶质细胞和少突神经胶质细胞。对受体的研究发现，PDGF-A受体在NSCs分化过程中持续表达，PDGF-B在未定型细胞中无表达，分化时表达增加。4.IL-1和淋巴细胞抑制因子（lymphocytesinhibitoryfactor,LIF)这两种因子均可显著提高细胞生长率，IL-6、IL-l1、IL-12、LIF和粒细胞克隆刺激因子对少突胶质细胞系的成熟有诱导作用。LIF等因子通过LIF受体在发育期及成熟神经系统内发挥各种作用，在不同的细胞类型有不同的作用，能调节信号向下传递的因素决定了神经前体细胞的分化方向。5.神经细胞粘附分子（neuralcelladhesionmolecules,N-CAMs）这是细胞外基质蛋白，参与细胞间的相互作用，并调控NSCs的增殖、迁移和分化。实验表明，N-CAMs可以抑制海马前体细胞的增殖，呈剂量依赖性，并诱导其向神经元方向分化。76.骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP)在神经系统发育中发挥多种作用，并对神经营养因子的作用产生影响。BMP2和BMP7增强出生后和成体神经前体细胞向星形胶质细胞分化，抑制向少突胶质细胞分化，且不依赖于EGF受体的活化。7.维甲酸(RA)与甲状腺素(T3)通过提高NSCs内p21的表达，使其退出细胞周期进入分化，能够诱导源于成年大鼠海马的多能细胞分化为神经元，且上调trk受体，神经营养因子作用于此受体后，能促进细胞进一步成熟，有时能诱导出多巴胺神经元。T3还可以促进NSCs向少突胶质细胞分化。（二）化学物质1.一氧化氮能促进NSCs的分化，并能促进细胞分化后轴突的发育。2.硝普钠作为外源性的一氧化氮供体，可以抑制脊髓源性NSCs的增殖，并可诱导其向神经元的分化，而抑制其向星形胶质细胞分化，浓度越大作用越强。3.水杨酸可促进下丘脑来源的NSCs分化为谷氨酸阳性的神经元。4.乙醇可抑制放射状胶质细胞分化为神经元和神经胶质细胞。（三）微环境除上述因素外，局部环境因素也对NSCs的分化起着调控作用。如适宜的NSCs接种密度有利于其增生和分化。血清可以诱导体外培养大鼠的NSCs分化，大多数细胞分化成神经细胞，少量分化成神经胶质细胞。血清浓度的高低可以决定干细胞分化为神经元和神经胶质细胞的比例，并且对所分化的胶质细胞的种类也有影响。无血清培养的NSCs趋向于向神经元分化。Schwann细胞的分泌物不仅能够诱导共培