脂质体的应用与制备

脂质体应用及其制备卢铭辉20110006015脂质体—结构英国科学家庞汉姆等在1965年进行生物膜研究时，发现磷脂分子在水中分散后能够自发的形成一种囊泡体，这种囊泡体具有类似于细胞膜的双分子层结构，他将这种囊泡体称为脂质体。20世纪70年代初用脂质体作为药物载体包埋淀粉葡萄糖苷酶治疗糖原沉积病首次获得成功后,脂质体便引起了广泛关注。磷脂分子具有一个亲水的极性头部和一个疏水的非极性尾部，因此在组成脂质体时，磷脂的亲水极性头部位于脂质体双分子层的外部，疏水的非极性尾部朝向脂质体双分子层的中间。脂质体(liposome)是单层或多层脂质双分子膜以同心圆的形式包封而成,类似细胞膜的微球体。脂质体按照不同的直径大小以及内囊数目可分为以下几种类型：√直径小于100nm的小单层脂质体(SUV)√直径大于100nm的大单层脂质体(LUV)√多层同心的多层脂质体(MLV)√非同心多囊泡脂质体(MVL)作用：脂质体的囊泡结构能够充当药物分子或其他物质等的载体。亲脂性的药物可以储存在磷脂双分子层中，亲水性的药物可以存储在脂质体的内囊中。脂质体—分类应用√长循环脂质体长循环脂质体是指经过修饰作用的具有一定空间稳定性的脂质体，常见的修饰物有聚乙二醇（PEG）、神经节苷脂（GM1）等。因其具有空间稳定性，所以长循环脂质体可在体内长时间驻留，进而使药物的作用时间得到延长，发挥出长效作用。GM1能够增强脂质体膜的刚性，减少单核吞噬细胞系统（MPS）对长循环脂质体的吞噬率。PEG可以在脂质体的表面产生空间位阻层，以使长循环脂质体不被内皮网状系统（RES）吞噬，进而延长药物作用时间。√热敏脂质体热敏脂质体又叫温度敏感脂质体，其所使用的磷脂具有比人体体温稍高的相变温度，在当环境温度达到相变温度时，脂质体双分子层会由“胶晶态”转变为膜流动性更强的“液晶态”，从而促使脂质体所包封药物的释放率加大。在研究中，有学者提出将肿瘤等病灶部位升温，使局部温度能够高于热敏脂质体的相变温度，可以使抗肿瘤药物在肿瘤病灶部位快速释放，来提高脂质体的靶向治疗作用。热敏脂质体已被广泛的应用于核酸、抗生素和抗肿瘤药物等的载体研究，尤其在抗肿瘤药物载体方向的研究已经取得了较深入的成果。√pH敏感脂质体pH敏感脂质体是基于肿瘤间质处的pH值比正常组织低的特点而设计的一种具有细胞内靶向和控制药物释放作用的脂质体。目前常用的PH敏感脂质体为二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。当脂质体处于中性pH环境时,DOPE的羧基离子可提供有效静电进行排斥,使脂质体保持稳定,当pH改变时,双层脂质体可转变成六角相,引发脂质体膜不稳定、聚集、融合、释放内容物。从而将包封物导入细胞质并主动靶向到病变组织,提高药物的靶向性。√免疫脂质体脂质体的表面连接上抗体或受体，则可通过特异性结合作用，使脂质体的移动具有靶向性，这样的脂质体叫做免疫脂质体。由于其具有运载量大、靶向性强和毒副作用小等优点，也被学者研究来用于肿瘤靶向治疗。√磁性脂质体磁性脂质体是在脂质体中掺入铁磁性物质制成,在体外磁场的作用下,把抗肿瘤药物选择性地输送和定位于靶细胞,从而降低药量,减少毒性，提高疗效。在交变磁场作用下,到达靶区的磁场粒子能迅速升温至有效治疗温度,导致肿瘤组织坏死,而无磁性脂质体的正常组织则不受损伤。脂质体—制备√实验原理常见的磷脂分子结构中有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。将适量的磷脂加至水或缓冲溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此相对缔和为双分子层，构成脂质体。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱等。常用的附加剂为胆固醇。胆固醇也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制得稳定的脂质体，其作用是调节双分子层的流动性，降低脂质体膜的通透性。其他附加剂有十八胺、磷脂酸等，这些附加剂能改变脂质体表面的电荷性质，从而改变脂质体的包封率、体内外稳定性、体内分布等其他相关参数。2.实验方法在制备含药脂质体时，根据药物装载的机理不同，可分为“主动载药”与“被动载药”两大类。所谓“主动载药”，即通过脂质体内外水相的不同离子或化合物梯度进行载药，主要有K+-Na+梯度和H+梯度(即pH梯度)等。传统上，人们采用最多的方法是“被动载药”法。“被动载药”即首先将药物溶于水相或有机相(脂溶性药物)中，然后按所选择的脂质体制备方法制备含药脂质体。对于脂溶性的、与磷脂膜亲和力高的药物，“被动载药”法较为适用。而对于两亲性药物，其两相分配系数受介质的pH值和离子强度的影响较大，包封条件的较小变化，就有可能使包封率有较大的变化，首选“主动载药”方法。下图是“主动载药”中pH梯度法载药原理示意图。H+H+DDDH+DH+insideacidpHoudsideneutralpH被动载药(1)薄膜分散法将磷脂溶解于适量的氯仿或乙醚等有机溶剂中，在旋转蒸发仪上旋转蒸发使磷脂干燥，使磷脂在瓶壁上形成一层脂质薄膜。使用合适的溶液来水化已干燥的脂质薄膜，并根据磷脂的浓度，通过振摇、超声或涡旋震荡等方式进行处理，得到的主要是大多室脂质体的混悬液。(2)复乳法先将脂质体的膜材和脂溶性药物溶于适量有机溶剂中，按比例加入少量水相溶液，通过超声或震荡等方法进行处理以得到状态稳定的W/O乳化液，再加入大量水相溶液进行第二次乳化处理，得到W/O/W乳化液，再通过减压蒸发除去有机溶剂，即得到脂质体悬液。（3）逆相蒸发法将磷脂等脂溶性成分溶于有机溶剂，再按一定比例与含药的缓冲液混合、乳化，然后减压蒸去有机溶剂即可形成脂质体。该法适合于水溶性药物、大分子活性物质，如胰岛素等的脂质体制备，可提高包封率。脂质体包封率的测定评价脂质体质量的指标有粒径、粒径分布和包封率等。其中脂质体的包封率是衡量脂质体内在质量的一个重要指标。脂质体包封率是指被包裹物质（如某药物）在脂质体悬液中占药物总量的百分量。决定其包封率的因素为药物与磷脂膜的作用力、膜材的组成、脂质体的内水相体积、脂质体数目及药脂比(药物与磷脂膜材比)等。常见的包封率测定方法有分子筛法、超速离心法、超滤法、阳离子交换树脂法。“阳离子交换树脂法”是利用离子交换作用，将荷正电的未包入脂质体中的药物(即游离药物)，通过阳离子交换树脂吸附除去，包封于脂质体中的药物，由于脂质体荷负电荷，不能被阳离子交换树脂吸附，从而达到分离目的，进而测定包封率。原理示意图见下图。Na+SO-3Na+SO-3Na+SO-3Na+SO-3Ber+Ber+Ber+Ber+Ber－－－－－－－－－－－－以龙胆苦苷为例制备龙胆苦苷脂质体。龙胆具有利胆、抗炎、健胃、降压等作用。龙胆中主含环烯醚萜苷类成分，龙胆苦苷为其中主要有效成分。实验步骤：1.提纯龙胆苦苷2.制龙胆苦苷标准溶液，作标准曲线（为包封率的测定做准备）3.检测龙胆苦苷的稳定性以及仪器的精密度4.选择了复乳法、薄膜水化法、逆相蒸发法等三种脂质体常见制备方法进行制备龙胆苦苷脂质体。√复乳法：准确称取卵磷脂以及胆固醇于圆底旋蒸瓶中，加入乙醚将其溶解，量取的龙胆苦苷溶液与之混合，用超声波细胞粉碎仪进行超声处理，形成W/O型乳化液，加入超纯水作为外水相，继续超声处理，形成W/O/W型乳化剂，将其置于旋转蒸发仪上，在水浴、真空的条件下旋转蒸发除去有机溶剂，定容。即得到脂质体悬液。√薄膜水化法准确称取卵磷脂以及胆固醇于圆底旋蒸瓶中，加入乙醚将其溶解置于旋转蒸发仪上，在水浴、真空的条件下旋转蒸发除去有机溶剂直至圆底旋蒸瓶的瓶壁上形成均匀的脂质薄膜，量取龙胆苦苷溶液与之混合，在漩涡混合器上振摇后，并用超声波细胞粉碎仪进行超声处理，定容。即得到脂质体悬液。√逆相蒸发法准确称取卵磷脂以及胆固醇于圆底旋蒸瓶中，加入乙醚将其溶解，取龙胆苦苷溶液与之混合，并用超声波细胞粉碎仪进行超声处理，形成W/O型乳化液，将其置于旋转蒸发仪上，在水浴、真空条件下旋转蒸发至生成反胶束凝胶，继续维持真空度旋蒸至反胶束凝胶塌陷生成水混悬液，定容。即得到脂质体悬液。5.包封率的测定分别量取相同体积脂质体悬液置于两支离心管中。向其中一支离心管加入的曲拉通溶液并置于水浴中进行破乳，按标准曲线测定方法进行测定，并根据标准曲线计算溶液中龙胆苦苷的总浓度C总。向另一支离心管中加入的鱼精蛋白溶液，混匀后静置，用台式冷冻离心机进行离心，取上清液定容，按标准曲线测定方法进行测定，根据标准曲线计算溶液中游离的龙胆苦苷的浓度C游离。然后使用公式：EE（%）=（C总-C游离）/C总×100%6.储存—水相的选择。脂质体通常以静脉注射作为给药途径，合适的水相选择是必要的。影响脂质体制备的因素：药液浓度，胆固醇与卵磷脂质量比，有机相与内水相体积比，超声功率，水浴温度，减压蒸发时间等。结语新型脂质体的研究已从单一脂质体向多功能脂质体如pH敏感免疫脂质体、热敏感长循环脂质体等方向发展.这些脂质体在稳定性、靶向性和疗效方面都比传统脂质体有明显改善,但成本，简化完善制备工艺仍是脂质体在药物载体应用上的关键问题。参考文献：[1]姚新武.脂质体的制备及应用研究[D].北京化工大学,2012.[2]杨彤.新型脂质体的研究进展[J].医药导报,2009,03:336-338.[3]朱斌,许时婴,夏书芹.薄膜水化法制备辅酶Q_(10)脂质体[J].食品与机械,2006,06:39-41+79.[4]陈淑花,詹世平,张晶,陈理.超临界逆向蒸发法制备葡萄糖脂质体实验及性能表征[J].大连大学学报,2012,06:37-40.[5]蒲宝婵,赵骏,邱超,张雪.复乳法制备龙胆苦苷脂质体[J].药物评价研究,2011,06:428-431.[6]叶鹏,宋金春,郭咸希.pH梯度法结合逆向蒸发法制备氟尿嘧啶脂质体[J].中国药师,2009,03:308-311.谢谢！