第七章高通量基因组测序技术介绍11-25

高通量测序应用与进展南京师范大学比较基因组学与生物信息学实验室•纲要•高通量测序简介•高通量测序平台的介绍•高通量测序的应用范围及案例分析•相关生物信息学分析软件介绍•高通量测序简介•高通量测序:一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，又称为下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。•High-throughputSequencing•NextGenerationSequencing•DeepSequencing3•高通量测序流程文库扩增低通量ASanger测序B高通量测序并行测序高通量无需建立文库，两端加测序接头PCR扩增•高通量测序技术的起源与发展•1992年LynxTherapeuticsMPSS•2003年PolonySequencing（哈佛）•2005年454Pyrosequencing•2006年SolexaSequencing-by-Synthesis•2007年ABISOLiD•2008年HelicostSMSSequencing•2010年IontorrentSemiconductorSequensing•2011年PacificBiosciencesSMRTSequensing5LynxTherapeuticsMPSS极其复杂，没有商业化，2004年并入solexa。Polonyseq由哈佛GeorgeChurch实验室开发，使用连接测序，后来并入ABISOLiD平台。454焦磷酸测序由454LifeSciences开发，是第一个商业化高通量测序平台，后被Roche收购。Solexa在lynxMPSS的基础上简化开发了SequencingbySynthesis，后被Illumina收购。ABISOLiD在PolonySeq基础上开发了连接测序。Helicos是单分子测序，其特点是没有PCR扩增过程。2010的Iontorrent和其他的不同，不是以荧光进行检测信号•高通量测序技术的传承关系图LynxMPSSSolexaABISOLiD454IonTorrentHelicosSMRTIlluminaSolexaRoche454PolonySeqABIIonTorrent•现有主要高通量测序仪开发商测序仪品牌技术原理开发商Roche454焦磷酸测序RocheIlluminaSolexa边合成边测序IlluminaABISOLiD基于磁珠的大规模并行连接测序ABIHelicos单分子荧光测序HelicosIonTorrent半导体测序ABISMRT单分子实时测序PacificBio•454高通量测序法结合了DNA扩增的乳胶系统（emulsionsystem）和焦磷酸测序的方法,即一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术;在DNA聚合酶,ATP硫酸化酶,荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度,就可以达到实时测定DNA序列的目的。•基本原理454测序原理•基于磁珠的焦磷酸测序：A磁珠制备设备B454测序仪•454测序流程将基因组打成较短的DNA片段，再将片段与接头相连，以使其更容易与磁珠结合在一起。将PCR产物包被于“油包水”的乳化剂中，每一滴乳化剂内除PCR产物外，还含有一个结合了一个DNA片段的磁珠，这样，PCR扩增过程就可以在每一滴乳化剂内独立进行，而没有其它竞争性或者污染性序列的影响，使整个DNA片段进行平行扩增。454测序-DNA样品制备扩增反应完成后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到PicoTiterPlate板（一种光纤载板）的样品孔内供后继测序使用了。在光纤PicoTiterPlate板样品孔内还有测序过程所需的酶类及引物（引物与DNA片段末端的接头序列互补），当未经荧光标记的核苷酸流经过样品孔时，每次只允许一个互补dNTP接入，进行互补新链的合成。每当一个核苷酸连接到新链上时，就会释放一分子的焦磷酸盐（PPi），而后PPi与相应底物反应形成1分子ATP，ATP再驱动荧光素酶转变为氧化荧光素酶，而氧化荧光素酶可以发出可见光，可被检测仪器捕获，形成峰图。该技术的序列阅读长度介于100到150个核苷酸之间。•454测序-结果•454的特点与主要应用•读长较长，400－600bp•通量较低，1Run1M序列，400－600Mb•相对成本较高•主要应用：denovo测序•454高通量测序法优势该方法是一种结合了一种乳胶材料和皮升级反应孔的焦磷酸盐测序法。它一个典型的反应可以在4小时内测出2千5百万个碱基，其准确率可达到99％。利用Sanger毛细管电泳法测序平均每个小时可读6万7千个碱基，平均准确率为99.4％。事实上，这种新的测序方法单个反应的读取碱基数和准确率都不及毛细管电泳法，它之所以能最后平均起来比经典方法强在于普通测序一次只能利用96孔板进行反应，而这种新型测序所采用的介质玻片上面有一百六十万个孔，平均下来自然比传统方法强。•IlluminaSolexa简介•桥式PCR•边合成边测序•可逆终止物HiSeq2000•IlluminaSolexa测序流程RandomlyfragmentgenomicDNAandligateadapterstobothendsofthefragments.Bindsingle-strandedfragmentsrandomlytotheinsidesurfaceoftheflowcellchannels.Addunlabelednucleotidesandenzymetoinitiatesolid-phasebridgeamplification.4.FragmentsBecomeDoubleStranded5.DenatureTheDouble-strandedMolecules6.CompleteAmplificationTheenzymeincorporatesnucleotidestobuilddoublestrandedbridgesonthesolid-phasesubstrate.Denaturationleavessingle-strandedtemplatesanchoredtothesubstrate.SeveralmilliondenseclustersofdoublestrandedDNAaregeneratedineachchanneloftheflowcell.Firstchemistrycycle:toinitiatethefirstsequencingcycle,addallfourlabeledreversibleterminators,primersandDNApolymeraseenzymetotheflowcell.Afterlaserexcitation,capturetheimageofemittedfluorescencefromeachclusterontheflowcell.Recordtheidentityofthefirstbaseforeachcluster.Secondchemistrycycle:toinitiatethenextsequencingcycle,addallfourlabeledreversibleterminatorsandenzymetotheflowcell.•IlluminaSolexa测序流程Afterlaserexcitation,collecttheimagedataasbefore.Recordtheidentityofthesecondbaseforeachcluster.Repeatcyclesofsequencingtodeterminethesequenceofbasesinagivenfragmentasinglebaseatattime.Aligndata,comparetoareference,andidentifysequencedifferences.•IlluminaSolexa桥式PCRdioldiol1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=35total1stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextension•IlluminaSolexaBaseCalling123789456TTTTTTTGT…TGCTACGAT…•Solexa的特点与主要应用•读长较短，100－150bp•通量高，25G每天，120-150G每Run•主要应用：RNA测序、表观遗传学研究Solexa的这种方法，可在一个反应中同时加入4种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS－sequencingbysynthesis），可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断,因此在同一个芯片或几个芯片上花费很少（只需常规方法的1％）的成本就可测试全基因组。Solexa方法的优点•ABISOLiD简介•SOLiDSequencingbyOligoLigation/Detection•Oligo连接测序：通过连接酶连接，再对oligo上荧光基团进行检测SOLiD5500xl•ABISOLiD测序前期制备A样品片段化磁珠连接B乳化PCR3‘末端修饰C磁珠富集转到测序玻片•ABISOLiD测序原理•ABISOLiD荧光结合和结果示例@SRR029969.1VAB_5551_12_381_F3length=35T11.0203.3.1113211010332111302330201+SRR029969.1VAB_5551_12_381_F3length=35!36!8/8:!:!462@6=(88.;2:*9748078@SRR029969.2VAB_5551_13_468_F3length=35T202312302.3333130131131322113203131+SRR029969.2VAB_5551_13_468_F3length=35!9),4/3)&$!(&(573(96,'7&91)43),(95,A.SOLiDOligo荧光基团模式图B.SOLiD测序结果示例（ColorSpace)•SOLiD的特点与主要应用•读长较短，50-75bp•精度高，可达Q40•通量高，20-30G每天，1Run可达120G•主要应用：基因组重测序、SNP检测等•三种平台的技术差异平台454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR桥式PCR磁珠乳化PCR测序载体磁珠玻片玻片测序方式焦磷酸、荧光可逆终止物、荧光连接酶、荧光结果序列FastQFastQCSFastQ•三种平台的效能参数差异平台读长通量周期精度SolexaHiSeq2000Single-end:1x35bpPaired-end:2x50bpPaired-end:2x100bp25Gb/d~1.5d~4d~8d•50bp85%以上Q30•100bp80%以上Q30SOLiD5500xlSingle-end:75bpPaired-end:75x35bpMate-pair:60x60bp20–30Gb/d1d/1lane7d/12lane7d/12laneQ40454GSFLX400-600bp400–600Mb/Run10hQ20•高通量测序应用范围•DNA测序全基因组denovo测序基因组重测序宏基因组测序人类外显子组捕获测序•RNA测序转录组测序小RNA测序电子表达谱测序•表观基因组研究ChIP-SeqDNA甲基化测序•基因组测序•基因组测序是对物种的基因组DNA打断后进行高通