色谱复习题答案整理

一．名词解释1capacityfact：容量因子，也称分配容量或容量比，用k′表示。其定义为：一定温度与压力下两相达平衡后，溶质在固定相和流动相中分配量（质量或摩尔数）之比.2分配系数：K,一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相中浓度的比值;3extra-columneffect：柱外效应，即除柱内多种因素产生的色谱峰扩张外，其它产生峰扩张的因素之和：进样系统，系统连接管，检测器及其它柱外因素引起的峰扩张。4gradientelution：梯度洗脱，在HPLC分析中，控制流动相组成或洗脱强度随时间的改变而改变，以使极性差异较大的多个组分均能分离,同时谱峰间隔较均匀，分析时间尽量短。5HPSEC：高效体积排阻色谱法,即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离的液相色谱方法。常用于肽和蛋白质的分子量分布测定及多步分离纯化程序中。其填料一般有硅胶基质和合成高聚物基质以及高交联多糖型凝胶三种。6ODS：十八烷基键合硅胶，又称C18.典型的反相色谱柱，表面键和的基团为非极性羟基，适于分离弱极性，中等极性，较强极性及可电离的酸碱性有机物。7基线：在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的连续的响应信号，一般是一条直线;8峰面积：色谱曲线与基线间所包围的面积;9半峰宽：亦称半宽度,半峰宽度,指色谱峰高一半处的宽度10标准偏差σ：正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。11死时间t0:流动相流过色谱柱所需时间(不保留组分流过色谱柱所需时间)12调整保留时间:tR’=tR-t0，指扣除死时间后的保留时间。13保留时间tR—进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。14相对保留值:(用γ或α表示,也称分离因子)两个组分调整保留值之比=tR2’/tR1’=VR2’/VR2’;15分离度:相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。16色谱柱效：每米柱长具有的理论塔板数定义为色谱柱效，它是衡量色谱柱分离效能高低的一种量度。1.在进行HPLC分析时，为防止分析柱污染，应采取哪些措施？1）．加一个保护柱（预柱），其固定相性质应与分离柱一样或相近。2）．样品要尽量净化，如沉淀蛋白，去除色素和无机盐等。3).样品分析结束后,应及时用适当溶剂清洗色谱柱.2.乙醇的沸点为78.3℃，丁酮的沸点为79.6℃，在气相色谱柱上是否一定是乙醇先出峰，丁酮后出峰，为什么？不一定.因为保留值除与样品组分的沸点有关外，还与样品及固定相的极性有关。乙醇（bp78℃）和丁酮（bp80℃）二个组分在非极性柱上，因为组分出峰的顺序由蒸汽压决定，沸点高的保留时间长，所以乙醇先出峰，丁酮后出峰；在极性柱上，沸点和分子之间作用力同时作用，在强极性柱上分子间的作用力其主要作用，按极性大小出峰，乙醇的极性比丁酮大，所以丁酮先出峰，乙醇后出峰。4.电喷雾离子化的原理是什么?离子化过程分哪三步？原理：在喷针针头与施加电压的电极之间形成强电场，该电场使液滴带电，带电的溶液在电场的作用下向带相反电荷的电极运动，并形成带电的液滴。由于小液滴的分散比表面积增大，在电场中迅速蒸发，结果是带点液滴表面单位面积的场强极高，从而产生液滴的“爆裂”。重复此过程，最终产生分子离子。ESI离子化可分为一下三个步骤：1）形成带电液滴：在ESI高压电极处施以正的高电压，小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的正电荷，从而产生电化学反应，通过溶剂组分氧化而去掉负离子或通过毛细管自身的氧化而增加正离子，当在ESI高电压极处施以负的高压，小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的负电荷；2）溶剂蒸发和小液滴破裂：随着溶剂蒸发，液滴半径缩小，液滴表面电荷斥力增大，达到一定半径时，克服表面张力而裂解，重复此过程形成非常小的液滴；3）形成气相离子：对于半径=10nm液滴，电荷的斥力作用导致离子从液滴表面蒸发而不是液滴的分裂9、HPLC与GC比较，其特点？分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只占有机物总数的20%；HPLC可以分析较高沸点、较高分子量的、稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的作用：GC采用的流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，与组分之间基本没有作用；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的条件自由度较大。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过流动相组成来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC常常在室温下进行。10、UVD紫外,FLD荧光,RID示差折光,ELSD蒸发光散射-这些检测器哪些是通用型的检测器？哪些是选择性检测器？哪些可与梯度洗脱兼容？哪些不兼容？UVD紫外:由于不是所有化合物都有UV吸收，因此不是通用检测器;与梯度洗脱兼容FLD荧光:许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射激发后，发射出较激发光波长要长的荧光。ELSD蒸发光散射：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的且挥发性较小的样品组分的检测。RID示差折光：是一种通用型检测器,只要被测组分与流动相的折光率有差别就可使用。与梯度洗脱不兼容,价格较高。RID，ELSD是通用型检测器。UVD,FLD,是选择性检测器。UVD,FLD,ELSD与梯度洗脱兼容。RID与梯度洗脱不兼容。11、气相色谱分析中样品的衍生化处理的目的及作用?待试样品在适当条件下与所选试剂作用使其转化成为满足色谱分析要求的衍生物后再进行色谱分析。目的：（1）增加试样的挥发性和稳定性，从而扩大气相色谱的应用范围（2）改善分离效果，改进组分吸咐特性。（3）帮助未知物定性，增加检测灵敏度和增加定量可靠性12、请简述气相色谱法分析油脂的脂肪酸组成样品前处理过程?取约3～5滴植物油样品于20ml试管中，加入0.5mol/L的NaOH甲醇溶液2ml，60℃水浴中加热至油珠完全溶解（约30min），冷却后加入25%BF3甲醇溶液2ml，60℃水浴酯化20min，冷却后加入2ml正已烷，振摇，加入2ml饱和NaCl溶液振摇，离心取上层有机相于一只干燥试管中并加入少量无水硫酸钠以除去微量的水，供分析使用。13、什么样的反相柱不会发生“疏水塌陷”？对于硅胶基质填料上的反相键合相---内嵌极性基团的反相键合相，极性基团增加了表面水的浓度即改善与水的浸润性；如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，被分析物的保留时间会显著降低，即“疏水塌陷”。保留时间与填料表面积及配体（内嵌极性基团）有关。注意：几乎所有的表面积都在孔内！14、流动相脱气的目的？有哪几种脱气方式？流动相脱气的目的①使色谱泵的输液准确：输液量均匀准确，并且脉动减小；保留时间及色谱峰面积的重现性提高②提高检测的性能：防止气泡引起的尖峰；基线稳定，信噪比增加；溶剂的紫外吸收本底降低③保护色谱柱：减少死体积；防止填料的氧化在线脱气装置用于脱去溶解在流动相中的气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线漂移，噪音增加。除在线脱气装置外，目前也有采用离线超声脱气、真空脱气、氦气脱气等方式。五．应用题1.离子抑制色谱技术在食品分析中应用较广，请举出一实例说明其技术的原理，并写出色谱条件和样品处理方法。红葡萄酒中酚类化合物样品预处理：将25ｍL红葡萄酒样品通过聚酰胺柱（259ｍｍ×17mmi.d.）,用5ｇPolgamid-6(Serva)装填，并先用pH2.5的酸性水平衡），以100ｍL蒸馏水淋洗，再用150ｍL30％的甲醇（酸化至PH2.5）洗脱，洗脱液真空浓缩至5ｍL左右，并用15％甲醇定容至10ｍL。色谱柱：ODS柱（125mm×4mmI.D.,），室温流动相：体积比为85:15的水－甲醇（用HClO3调PH2.5）流速：1.0ml/min检测：UV-280nm样品：红葡萄酒原理:多酚、有机酸。pH2-3,酸性条件下，电离受到抑制，保留值增大，就可以得到分离，不在酸性条件下，阴离子状态不保留，流出色谱柱，就不能分离。2.请简述检测果酒或黄酒中的中性酚和酸性酚的样品处理方法和色谱条件(选用什么色谱柱和流动相及检测器?检测波长大致多少nm。预处理:(1)去除大分子,蛋白,用乙醇沉淀(2)中性酚或酸性酚:中性条件下用液液萃取(乙醚,乙酸乙酯萃取)。酸性条件下,也可用乙醚,乙酸乙酯.或固相萃取法.色谱条件：C18柱流动相：乙腈:水:三氟乙酸紫外检测器检测波长270-280nm称取一定量的酚类物质，溶于少量水，在棕色容量瓶中定容至10mL，浓度分别为：儿茶素52.0mg/L，绿原酸40.0mg/L，咖啡酸44.0mg/L，表儿茶素44.0mg/L，香豆酸60.0mg/L，阿魏酸44.0mg/L，摇匀，放入冰箱4°C避光储存备用。配制标准溶液时，采用逐级稀释法配成一系列浓度的混合标准溶液。取25mL原料用1mol/LNaOH溶液调pH值至7.0，加入25mL乙酸乙酯，用混合摇床震荡10min，然后转移到分液漏斗中分离，水相再用25mL乙酸乙酯萃取1次，合并酯相为中性酚。水相再用6mol/L的HCl溶液调pH值至2.0，再分别用25mL乙酸乙酯萃取2次，合并酯相为酸性酚。将中性酚和酸性酚合并后浓缩至干，残渣溶于水中，并在棕色容量瓶中定容至25mL，用0.22μm滤膜过滤，滤液于冰箱4℃储存待测。色谱柱：EclipseXDBC１8(150mm×4.6mmi．d．，5μm)，流动相：A为甲醇；B为1％乙酸水溶液(V/V)；梯度洗脱程序：溶剂A在40min内由5％上升到30％，然后变为100％，并维持5min，最后再返回到初始状态。柱温：30℃；流速：1.0mL/min光电二极管阵列检测器；检测波长：280nm；进样量：20μL。3.请设计出测定某一多糖样品的分子量分布或单糖组成的色谱分析方法（包括样品处理方法和色谱条件）。高效液相色谱法测定果汁的糖类组分含量1）、标准溶液系列配制分别准确称取各种糖标准品100mg左右于10ml容量瓶中，用超纯水溶解定容摇匀后，即得10mg/ｍＬ左右的标准溶液，再以此逐级稀释成8mg/mＬ,6mg/mＬ,4mg/mＬ,2mg/mＬ,1mg/mＬ的标准溶液系列，均经0.45μm微孔膜过滤，滤液供进样用。2）、样品处理准确量取3ml果汁至10ml容量瓶中用无水乙醇定容至刻度，离心后取上清液在热水浴条件下用氮气将乙醇吹去，再用水定容，并用0.45um有机相微孔膜过滤，滤液颜色若较深，再用Sep-PakC18固相萃取小柱处理去除色素等杂质，处理后的样液上机测定。3）、上机测定色谱柱：Sugarpak1,6.5mmid×300mm流动相：纯水检测器灵酸敏度：4柱温：85℃流速：0.4ml/min进样体积：10μL4.分析多糖或多肽的分子量分布应采用何种色谱分离模式?请简述该色谱模式的基本原理.高效凝胶过滤色谱（HPGFC）分析基本原理：按分子体积大小洗脱，凝胶色谱柱的选择主要取决于被分离样品的性质和糖组分分子量大小，以凝胶过滤色谱分析多糖的流动相一般为盐溶液。用多个不同分子量的标准品作分子校正曲线(分子量对数对保留时间或保留体积作图，一般为线性)，其分子量测定结果是一相对值，不是绝对分子量。6、计算题:若在一个色谱图上,测得tr=5.37cm,tm=0.52cm,w=1.32cm,假定柱长为1m,计算:(1)理论塔板数和有效理论塔板数.（2）塔板高度及有效塔板高度（3）分配比（1）265，216（2）3.77mm,4.63mm（3）9.3注：N=5.54(h/2Rwt)2=16(wtR)2根据色谱柱长L和理论塔板数N，可求出每个塔板高度H=L/NNeff=16(wtR)2=5.54(h/2Rwt)2TR’=TR-TMHeff=effNLk=(tr-tm/)tm7、三聚氰胺的化学结构如下，请据此