紫皮大蒜和白皮大蒜中大蒜素含量的对比08科三马杏贤许爱娟叶晓阳

1紫皮大蒜和白皮大蒜中大蒜素含量的对比华南师范大学生命科学学院生物科学马杏贤3874633415017506814许爱娟3874634215017514985叶晓阳3874634213640700592摘要本实验先使用同一种有机溶剂——95%乙醇（分析纯）分别提取紫皮大蒜皮和蒜肉及白皮大蒜皮和蒜肉中的大蒜素，再利用1.0mmol/L半胱氨酸溶液和1.0mmol/LDTNB溶液1mL反应产生黄色物质NTB，通过可见光分光光度计在412nm波长下测量NTB的吸光值来计算大蒜素含量。从多组平行和对照实验组中对比分析大蒜素含量，为大蒜素提取工艺更好地选材提供依据。关键词：紫皮大蒜白皮大蒜大蒜素大蒜素含量1前言大蒜是百合科一年生蔬菜，具有特殊的香辛气味,能促进消化、增进食欲以及具有显著的保健作用和巨大的药用价值。,其中大蒜素是大蒜的主要活性成分,是一种硫化丙烯类物质。具多种生物活性，被誉为天然广谱抗生素，有抗真菌、抗细菌、降血酯、降血压、防治动脉粥样硬化等心血管疾病的作用，并具有良好的抗癌，防癌的作用。但在新鲜的大蒜中并不含有大蒜素，只含有它的前体——蒜氨酸，以稳定、无臭的形式存在于大蒜中,当大蒜破碎后,蒜氨酸在内源蒜酶的催化下,经过充分接触反应生成大蒜素,但大蒜素极不稳定,易进一步分解成其他小分子的含硫化合物,并产生强烈的蒜臭味。大蒜素具有巨大的价值，但其提取率比较低，成本也高，因而有许多有关大蒜素提取方法的探究或改进实验。而在考虑紫皮和白皮大蒜中大蒜素含量及紫皮大蒜和白皮大蒜的皮与大蒜素含量关系的实验却比较少，因而探究不同大蒜（本实验主要是市场常售的紫皮和白皮两种大蒜）在有皮大蒜，无皮大蒜和单独蒜皮的情况下比较大蒜素的含量就有了一定的意义。本实验正是本着为工艺制取大蒜素选材提供一个参考和依据。22实验目的1）学会通过查阅文献等方法设计一个完整可行的实验2）掌握缓冲溶液的配置及分光光度计等常见生化实验器材的使用。3）了解从大蒜中提取和测定大蒜素的原理及相关不常见仪器的使用。4）学会从大蒜中提取和测定大蒜素的操作方法。5）学会通过探究紫皮大蒜和白皮大蒜中大蒜素提取率的不同，来探讨提取大蒜素的最佳材料。6）测量大蒜皮中大蒜素的含量，更有利于大蒜素的提取和利用。3实验原理3.1大蒜素的提取大蒜素纯品为无色油状物,具有大蒜异味。新鲜的大蒜中并不含有大蒜素，当大蒜破碎后,蒜氨酸在内源蒜酶的催化下,经过充分接触反应生成大蒜素,这是酶解过程。而相对于水来说，大蒜素易溶于乙醇、苯、乙醚等有机溶剂，故用乙醇进行提取。而参考大蒜素的提取工艺研究[1],用95%的乙醇使得大蒜素的萃取率最高，而且萃取温度为常温时，萃取的效果也比较好。乙醇易于挥发，用蒸馏的方法可以分离乙醇和大蒜素，在50℃、0.01MPa下，大蒜素的提取率最高。压强过低,大蒜素容易直接随有机相进人旋转蒸发仪的接受瓶。压强过高,有机相又不易挥发出来,导致蒸馏时间过长。因而需减压蒸馏的方法进行分离（蒸馏装置也可用普通蒸馏装置和真空泵完成）3.2大蒜素含量的测定一分子大蒜素(C6H10S2O)和两分子半胱氨酸(C3H7NO2S)反应生成两分子S-AMC(C3H5-S-S-CH2CH-(NH)2COOH)。将过量的半胱氨酸与大蒜素反应,用DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))法测定反应前后半胱氨酸量,也就是一分子半胱氨酸与一分子DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))反应生成黄色物质NTB(2-硝基-5-硫代苯甲酸),NTB在412nm处有最大吸收,摩尔消光系数为14150(光径1cm),用分光光度法测得半胱氨酸含量。然后根据半胱氨酸减少量计算出大蒜素含量。4实验设备一台组织捣碎机，一台恒温水浴箱，一台离心机，一台可见光分光光度计，减压蒸馏装置一套（或用普通蒸馏装置和真空抽气泵），比色杯一套，试剂瓶4个，18个500ml锥形瓶，6个500ml烧杯,7支10ml移液管，3支1ml移液管，4支胶头滴管，6只药勺，标签3纸，20支10ml试管，1个洗液瓶，2个棕色瓶5实验材料及试剂a试剂的配置蒸馏水，95%的乙醇，50mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲溶液（由Tris-Base(Sigma)加HCl配制）,1.0mmol/LDTNB（5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液由DTNB(Sigma)加50mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲溶液配制,存于棕色瓶中）;1.0mmol/LL-半胱氨酸溶液（由L-半胱氨酸(Sigma)加50mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲溶液配制,现用现配）。b材料的处理新鲜的紫皮大蒜和白皮大蒜（市售）6实验操作步骤6.1大蒜素的提取6.1.1准备足够量的紫皮大蒜和白皮大蒜，去掉最外面脏、老的部分皮后，用蒸馏水清洗干净至无明显污渍。然后分别剥取出紫皮大蒜的皮、白皮大蒜的皮、紫皮大蒜的蒜肉、白皮大蒜的蒜肉，放置好备用。6.1.2分别取180g紫皮大蒜的皮、白皮大蒜的皮、紫皮大蒜的蒜肉、白皮大蒜的蒜肉置于组织捣碎机捣成蒜泥，得到4份捣碎液。6.1.3分别取18锥形瓶，编号a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2、c3、d1、d2、d3、e1、e2、e3、f1、f2、f3。分别将40g紫皮大蒜的皮加入到a1、a2、a3中，将三份等量40g白皮大蒜的皮加入到b1、b2、b3中，将三份等量40g紫皮大蒜的蒜肉加入到c1、c2、c3中，将三份等量40g白皮大蒜的蒜肉加入到d1、d2、d3中，将三份20g紫皮大蒜和20g紫皮大蒜蒜肉加入到e1、e2、e3中，将三份20g白皮大蒜和20g白皮蒜肉加入到f1、f2、f3中。6.1.4将上述处理好的锥形瓶放到40℃恒温水浴箱中保温0.5小时，让其充分酶解。6.1.5取出上述保温后的锥形瓶，分别加入160mL95%乙醇（分析纯），轻微震荡，使其溶解，在常温下静置1小时。6.1.6向上述加入乙醇后的混合物分别离心机中离心，得到各上清液。（注：若有符合条件的蒸馏装置则进行第6.1.7步，若没有符合条件的装置也可直接进行下一步大蒜素含量的测定。）46.1.7每份上清液取等量10ml，将其置于减压蒸馏装置中，控制温度在50℃，旋转蒸发仪转速在75r/s进行减压浓缩。6.2大蒜素含量的测定6.2.1取50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与40.3ml0.1mol/L盐酸混匀并稀释至100ml，配制成50mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲溶液，保存在棕色瓶中备用。6.2.2取0.5mL1.0mmol/L半胱氨酸溶液,加1.0mmol/LDTNB溶液1mL,用50mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲溶液稀释至5.0mL,26℃保温15min,412nm波长测定其吸光值A0。6.2.3取0.5mL1.0mmol/L半胱氨酸溶液,分别加0.5mL6种待测上清液,26℃保温15min后加1.0mmol/LDTNB溶液1mL,用50mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲溶液稀释至5.0mL,26℃下保温15min,412nm波长测定半胱氨酸吸光值A。6.2.4记录各组A值，比较分析。记录表见表一表1各组上清液吸光值记录表吸光值组别A0A0平均值AA平均值△A412a1a2a3b1b2b3c1c2c3d1d2d3e1e25e3f1f2f37结果及计算7.1大蒜素含量计算方法C大蒜素(mmol/mL)=△A412×d/(2×14150)式中:△A412=A0-Ad为总稀释倍数；14150为NTB在412nm；1cm光径摩尔消光系数。7.2预期实验结果1）六种样品（即紫皮大蒜的皮，白皮大蒜的皮，紫皮大蒜的蒜肉，白皮大蒜的蒜肉，紫皮大蒜的皮的蒜肉，白皮大蒜的皮和蒜肉）计算得出的大蒜素的含量相差较大，含量由高到底依次为紫皮大蒜的皮和蒜肉，白皮大蒜的蒜肉，紫皮大蒜的蒜肉，白皮大蒜的蒜肉，紫皮大蒜的皮，白皮大蒜的皮。2）六种样品（即紫皮大蒜的皮，白皮大蒜的皮，紫皮大蒜的蒜肉，白皮大蒜的蒜肉，紫皮大蒜的皮的蒜肉，白皮大蒜的皮和蒜肉）计算得出的大蒜素的含量相差不大。可进行两种大蒜间的对比，预期结果为从紫皮大蒜得到的大蒜素含量高于白皮大蒜（各相同处理间对比）。3）六种样品（即紫皮大蒜的皮，白皮大蒜的皮，紫皮大蒜的蒜肉，白皮大蒜的蒜肉，紫皮大蒜的皮的蒜肉，白皮大蒜的皮和蒜肉）计算得到的大蒜素含量相差较大，各含量呈现不同的数量差异。8注意事项1）处理大蒜时注意保证大蒜和所需皮的整洁。2）配制和加入试剂的量注意保证准确和避免引入杂质。3）Tris溶液可以从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖盖严。4）测量吸光值时，比色杯要盖上盖子，防止乙醇挥发影响测量的准确性和稳定性。9费用预算材料单价(元/500g)数量（g）费用(元)总计（元）紫皮大蒜5100010226白皮大蒜3.5100075,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）1001005参考文献[1]曾哲,灵熊伟等.大蒜素的提取工艺研究[J].南昌大学食品科学报，2006,32（2）：121-123；[2]朱薿,应惠芳.大蒜中大蒜素含量简便测定法[J].食品安全与检测，2007，12（6）；[3]赵凤岭，陆明旦等.大蒜的保健作用及大蒜素的提取[J].山东轻工业学院学报，1997,11（1）；[4]孙翠玲,于大胜.大蒜素的提取及其应用[J].广州化工,2009,37(6)；[5]张申为,陈泉,高福才.大蒜素的提取及其注射液的制备[J].西安联合大学学报,2001,4(4)；[6]涂国荣，张孝忠.西藏大蒜干粉中大蒜素的提取与测定[J].西藏科技，2008（1）；[7]薛福连.大蒜素的提取技术[J].江苏调味副食品,2002[8]陈洪生,孔保华,刁静静.大蒜素提取条件的优化及抑菌活力的研究[J].食品工业科技，2007,4（28）；[9]李晓伏,张津.大蒜素的定量分析[J].信阳师范学院学报,1990,3(3)；[10]蒋思萍,陈彬,马超等.测定大蒜活性物质含硫化合物方法定硫法的改进和评价[J].西藏科技，2009（1）.附录表2Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L）的配置50毫升0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与X毫升0.1mol/L盐酸混匀并稀释至100毫升。pH(25℃)X(mL)7.1045.77.2044.77.3043.47.4042.077.5040.37.6038.57.7036.67.8034.57.9032.08.0029.28.1026.28.2022.98.3019.98.4017.28.5014.78.6012.48.7010.38.808.58.907.0