组织化学技术教程3

第四章普通组织化学普通组织化学是指以常用的组织化学技术，对细胞内主要化学成分和活性的粗略（一般性）的研究。本章就几个经典实验概要介绍如下：一、核酸（DNA和RNA）（一）化学特性1．分布：DNA（细胞核内）RNA（核仁10%；细胞质-核糖体90%）2．分子结构：戊糖+磷酸+碱基特点：①大量的磷酸基团→酸性（嗜碱性的基础）②戊糖—被盐酸水解→醛基（成为Feulgen法显示核酸的基础）②戊糖—被盐酸水解→醛基（成为Feulgen法显示核酸的基础）③可以完全水解或部分水解④可以用RNAase或DNAase消化[对照实验（—）]（一）显示方法1．福尔根（Feulgen）反应显示DNA[原理]在60℃温度下，将DNA用1N盐酸水解，DNA双链打开成单链，先释出碱基，然后脱氧核糖释出醛基，该醛基与Schiff氏液形成紫红色沉淀。[Schiff试剂显色原理]碱性品红亚硫酸→白亚黄酸（无色试剂，称为Schiff试剂）[方法]固定剂的选择可用一般的组织学固定液，常用Carnoy固定液。Carnoy固定液：纯酒：氯仿：冰醋酸=6：3：1(60ml)(30ml)(10ml)恒冷箱切片机的具体染色步骤如下：⑴切片固定在冰醋酸与纯乙醇（1：3V/V）中10分钟。⑵由乙醇降至蒸馏水中。⑶用1N盐酸浸泡。⑷放入预热到60℃的1N盐酸中，留6分钟。⑸放入室温的1N盐酸中。⑹放入Schiff液试剂，保持在暗处，60分钟⑺用新配制的SO2水浸洗3次（脱掉未反应的Schiff液）。⑻蒸馏水浸洗净（必须用蒸馏水→洗净无色品红，否则，残留试剂→有色品红）。⑼脱水透明、封固。结果：核内DNA染为红紫色。对照：仅改变第4步为1N盐酸，室温15分钟→（-）。[注意事项]⑴不用醛类固定剂如Bouin、戊二醛、丙烯醛等。常用Carnoy液、甲醇等。⑵控制水解时间，不同的固定剂用不同的时间，如：Carnoy8分钟；Genker5分钟；Susa18分钟★最适条件应自行试验。⑶控制温度，一般1N盐酸60℃；如果5N盐酸18～25度。⑷保证Schiff试剂的纯净度。⑸SO2要新配制，除去多余的Schiff液宜用之。⑹必须对照。2．显示核酸的其它方法⑴Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法⑵甲绿派若宁Methygreen-Pyronin显示DNA和RNA法⑶菊花青铬明矾（GC）显示核酸法⑷丫啶橙AcridineOrange显示DNA和RNA法⑸核酸提取法一、蛋白质（Protein）（一）蛋白质的分子结构蛋白质的基本单位是氨基酸，肽键将不同的氨基酸结合在一起，除氨基和羧基之外，还含有其它基团，如：—羟基、硫氢基、二硫基等。依其结构特点可分为：酸性氨基酸和碱性氨基酸；芳香族氨基酸：苯丙氨基酸、酪氨基酸；杂环类氨基酸：组氨基酸、色氨基酸、亚氨基酸、脯氨基酸、羟脯氨基酸。（二）目前应用1．用于蛋白质的一般定性①确定是否为蛋白质②确定蛋白质的酸碱性③显示蛋白质的特殊基团2．用于蛋白质功能定性和定位（三）染色方法目前，研究蛋白质功能定性和定位时多用酶组织化学法、配体—受体结合法、免疫组化法以显示特殊的蛋白质。这里仅介绍一般的染色方法。1．四氮化联邻茴香胺法（Tetra-azotized-o-anisidine）[应用]广泛应用于显示酶的活性[原理]芳香伯胺与亚硝酸作用，在低温下（＜5℃）可生成重氮盐，此即重氮反应。重氮盐可与酚类作用生成有色化合物——偶氮化合物。上述反应必须在酸性条件下进行。本实验，联邻茴香胺在酸性、低温条件下与亚硝酸作用生成四氮盐。四氮盐有两个重氮盐，其中一个重氮基在碱性条件下与所要显示的组氨酸、色氨酸及酪氨酸的苯环结合产生偶联反应，另一个重氮基与酚类或奈类发生偶联反应以增色。因此，可以用生成的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量。[方法]1．四氮盐配制⑴天平称取联邻茴香胺0.25g（有毒，通风橱内进行）。⑵在冰浴下，加入已预冷8%盐酸10ml，玻璃搅拌，促其溶解，混合后为悬浊液。⑶称NaNO20.15g溶于1ml蒸馏水中（冰浴下）。⑷在冰浴下，将配好的NaNO2溶液分三次倒入邻联茴香胺悬浊液内，每次倒入都须玻棒搅动，因产生NO2可有黄烟冒出，至黄烟停止再倒下一次液体。放入冰箱（4℃）内，约20分钟，待溶液变为黄色。⑸倾出上清液，勿将沉渣泛起，弃去沉渣。⑹用NaHCO3细粉（约0.5～0.6g）逐渐加入上清液内，边加边搅拌（冰浴下）。⑺以刚果红试纸测中和点，待试纸不变蓝即达到中和。收集于标本瓶（或广口瓶）内，置冰箱备用。此液不稳定，置冰箱内可保存两周，若变为橘红色则失效。2．偶氮反应—Carnoy固定的大鼠肝、肠等石蜡切片。⑴切片脱蜡至水。⑵将切片放入下列溶液中（在冰浴中至2～3℃），浸染10分钟。用前配制：四氮化联邻茴香胺溶液4ml0.1巴比妥缓冲液（pH9.2）20ml24ml⑶入1N盐酸（冰浴中2～3℃）浸洗10秒，多余盐酸以滤纸吸干。⑷入H酸饱和液，浸染30分钟（冰浴或冰箱内）。H酸饱和液配制：H酸0.4g0.1M巴比妥缓冲液20ml（pH9.2）过滤后使用！⑸蒸馏水冲洗，脱水、透明、封固（树胶）[结果]酪氨酸、组氨酸、色氨酸染成红棕色（+）※0.1M巴比妥钠50ml配制①分析天平称巴比妥钠（MW=206.18）1.0309g②于量瓶内+蒸馏水50ml至刻度即可。0.1M巴比妥缓冲液，pH9.2（20ml）配制:0.1M巴比妥钠19.1ml0.1N盐酸0.9ml20ml2．其它的显示蛋白质的方法⑴米朗反应（MillonReastion）→显示酪氨酸的方法酪氨酸→羟苯基亚硝酸→亚硝基苯+Hg→有色物注：胶原蛋白不显色，其它蛋白质都显色（+）⑵二硝基氟苯Dinitro—fluoro—benzene（DNFB）法DNFB与—NH2、SH和酪氨酸产生弱有色反应，可被偶氮染料加强。⑶酪氨酸重氮化偶联反应⑷蛋白质硫氢基DDD法（固定时避免氧化剂）⑸铁—铁氰化钾反应显示SH基⑹高甲酸阿尔辛蓝显示SS基法⑺免疫荧光法显示蛋白质三、碳水化合物中性多糖——糖原碳水化合物酸性多糖——硫酸软骨素A、B、C，肝素、硫酸角（组织中—多糖类）质素、透明质酸等蛋白多糖——粘蛋白、唾酸粘蛋白糖脂——脑苷脂类※组织中糖的种类较多，因此，要特异性地显示各种糖类必须用抑制和酶水解来对照实验。本章仅以高碘酸雪夫法（PAS法）说明之，其它的方法还有Alcianblue法，甲苯胺蓝异染性染色法等。高碘酸雪夫法Periodic—Schiff（PAS）method[原理]高碘酸为强氧化剂，它可以氧化多糖分子内1，2—乙二醇（顺式和反式）而产生醛基，此醛基再与Schiff试剂结合即产生红紫色。[方法]改良的McManus（1946），高碘酸雪夫法标本：①Carnoy固定的大白鼠肝、肾、肠石蜡切片②大白鼠肝横冷箱切片（未固定）[步骤](1)切片脱蜡入水（横冷箱切片免）(2)入0.5%高碘酸水溶液，室温，2～5分钟(3)蒸馏水涮洗(4)入Schiff试剂，洗3次，每次2分钟(5)入SO2水中，洗3次，每次2分钟(6)自来水洗5～10分钟(7)蒸馏水稍洗(8)入Mayer氏苏木精副复染核1分钟（9）自来水5分钟，换蒸馏水（10）脱水、透明、封固[结果]PAS（+）→红紫色或红色；核→蓝色Carnoy固定，糖原原位定位不佳，有移位现象。[对照]①用唾液酸淀粉于37℃消化20～30分钟。②苯甲酰或乙酰化法作对照（抑制法）[注意事项]①必须按照规定配方配制试剂，按规定的时间反应。以避免非特异反应。例如：入高碘酸水溶液时间不宜过长，否则非特异着色。②多糖大多都易溶于水，固定时应避免扩散或移位。冰冻切片+苦味酸福尔马林→固定→避免扩散或移位。③注意溶液的pH值：高碘酸液的pH不应超过5。④注意温度。反应宜在＜25℃的室温下进行，否则可氧化醛基为羧酸。⑤高碘酸溶液的浓度宜控制在0.5%～1%（0.02—0.1M）浓度过高则会发生非特异反应。⑥为充分显示多糖中的糖原，可在过碘酸中加入5%醋酸或纯乙醇固定，但往往有溶解和扩散。⑦为阻止胶原纤维和网状纤维阳性反应，可使用还原液，于使用Schiff液之前。[分析结果]PAS反应阳性物质：糖原、中性粘蛋白、中性唾液性粘蛋白。四、脂类[组织中的脂类]单纯脂类脂肪酸醇的化合物（如：甘油三脂等）复合脂类磷脂（卵磷脂，脑磷脂）脂类鞘磷脂糖脂（脑苷脂，神经苷脂）衍生脂类胆固醇肾上腺素性激素[显示脂类的基本原理]用易溶于脂类的染料，使之溶于所检的脂质（如脂滴）中，使组织内的脂类着色。[常用方法]苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼罗蓝法[基本要求]⑴不用石蜡切片。⑵固定剂一般用Formalin保存磷脂较好。⑶方法：①物理法：脂溶性染料，不溶于水，属偶氮染料。常用苏丹Ⅲ、Ⅳ，苏丹黑，油红O等。②化学方法：硫酸尼罗蓝显示脂肪酸。③选择性提取法（对照）实验举例：苏丹黑B法[原理]苏丹黑为偶氮染料，具有脂溶性，可溶于无水酒精，但不溶于水（常用70%酒精饱和液）。当组织切片入染液时，苏丹黑B便离开染液而溶于组织内的脂质（如脂滴中）使组织内脂类着色。标本：兔肾上腺和睾丸横冷箱切片，10μm厚，不固定（或用10%Formalin固定10分钟后水洗）。[方法]①入蒸馏水洗②于70%乙醇内涮洗③入苏丹黑B70%B饱和液，染5～10分钟④于50%酒精内浸洗⑤蒸馏水中洗⑥入Mayer苏木精（复染细胞核）1分钟⑦自来水冲洗5～10分钟⑧入蒸馏水⑨甘油明胶（或Apathy糖胶）封固[结果]细胞内脂滴均呈黑色