细胞衰老检查的实验技术及原理(一)

细胞衰老检查的实验技术及原理（一）关键词：细胞色素成纤维细胞酶磷酸试剂标准物质北京标准物质网衰老细胞的形态变化主要表现为形状变大、变平、胞核增大、核膜内陷、染色质固缩、胞内溶酶体变多等。衰老细胞中细胞器数量尤其是线粒体数量减少，胞质内有色素堆积和空泡形成，最终导致细胞死亡。总体来说衰老细胞的各种结构呈退行性变化。根据其特征，目前常用于检测衰老的方法如下：一、β-半乳糖苷酶活性1995年，Dimiri等发现体外培养二倍体成纤维细胞在培养基pH值为6时，其β-半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而逐渐上调，他们把这种中性β-半乳糖苷酶定义为SA-β-gal，即衰老相关的β-半乳糖苷酶。衰老细胞或组织产生的β-半乳糖苷酶可以催化底物X—Gal，生成深蓝色产物，从而在光学显微镜下很容易观察到(图5-5-1)。在人体表皮角质层细胞中，也可以发现SA-β-gal随年龄的增加而增加。并且，SA-β-gal不依赖于DNA复制，可以区分衰老细胞与静止期的细胞。SA-β-gal是一种体内体外都适用的检测衰老的生物标记物。由于检测SA-β-gal的方法简单易行，其在检测衰老细胞方面有很广泛的应用，目前已经有2400多篇论文应用了这种方法。二、端粒长度的检查端粒是位于真核细胞染色体末端顶部的核蛋白结构，由高度保守的TTAGGG重复序列组成，其存在可以保护染色体末端，是维持染色体稳定的重要因素。鉴于端粒的特殊结构，端粒的长度会随着每次细胞的分裂而缩短，因此，端粒长度是衰老的一个重要生物标志。这里我们主要讨论端粒限制性片段(TRF)分析及荧光原位杂交(FISH)法。端粒限制性片段分析：TRF分析也称作端粒的Southern印迹法，是应用针对端粒重复序列的探针来检测限制性酶切后所保留的端粒的方法。限制性酶会将基因组DNA消化为短的片段，留下大量完好的端粒，即所谓的端粒限制性片段。以凝胶电泳分离基因组片段，通过放射性探针(CCCTAA)。杂交“TTAGGG”重复序列的方式可以检测到端粒的存在。鉴于细胞的异质性，TRFs的大小不一，反映出细胞中端粒长度的不同。TRF分析对试剂和仪器无特殊要求，因此这种方法目前有着较为广泛的应用，但它存在一些缺陷，TRF分析测量的是整个样品端粒长度的平均值，由于不同端粒的长度相差很大，这种方法既不能分辨单个端粒也不能分辨单个细胞内端粒的平均长度。鉴于短端粒在电泳迁移中不集中且杂交信号弱，这种方法很难检测到在衰老研究中尤为重要的短端粒。另外，这种方法还存在操作复杂，所需样品量大等缺陷。相比之下，FISH技术样品用量小、直观、敏感，可以检测染色体问端粒长度的变化。荧光原位杂交：FISH端粒长度分析基于荧光肽核酸探针(PNA)的特异性标记。PNA探针是DNA同源的合成肽链，其中DNA带负电的磷酸戊糖骨架被不带电的N-2胺乙基甘氨酸骨架所取代。这样的修饰产牛了非常稳定高效的针对靶DNA的特异性杂交。PNA探针发出的荧光信号与所杂交的端粒长度直接相关，因此这种方法可用于测量端粒的长度。FISH不但可以应用于单细胞水平的单个染色体端粒长度的测量，还可应用于组织匀浆及组织切片(图5-5-2)。