细菌耐药表型的检测方法

细菌耐药表型的检测方法细菌耐药表型的检测一、β-内酰胺酶的检测（1）头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片→灭菌水湿润→涂测试菌于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观察）。（2）酸度法：青霉素→β-内酰胺酶水解→青霉酸、pH6.8以下→酚红指示剂由红色（构橼酸钠缓冲液pH8.5）变为黄色。（3）碘测定法：β-内酰胺酶破坏β-内酰胺环，碘与破坏后的β-内酰胺结合，使兰色的淀粉—碘复合物转变成无色。（4）仪器测定法：Vitek、Microscan的药物测试卡中均带有检酶功能。二、ESBLS检测（1）纸片扩散初筛：头孢他啶（30μg/片）抑菌圈≤22mm头孢噻肟（30μg/片）抑菌圈≤27mm头孢曲松（30μg/片）抑菌圈≤25mm氨曲南（30μg/片）抑菌圈≤27mm（2）肉汤稀释法：上述药物MIC≥2μg/ml可疑为ESBLS。（表型确证试验：对2个任何一个药物MIC，在加克位维酸比不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度判为ESBLS）。（3）双纸片协同确认试验：头孢他啶（30μg/片）与头孢他啶（30μg）/克位维酸（10μg）头孢噻肟（30μg/片）与头孢噻肟（30μg）/克拉维酸（10μg）两纸片抑菌圈相比≥5mm即为ESBLS。（4）E-test法（浓度梯度法）：由瑞典ABBiodisk公司研究生产，广洲贝肯公司经销。试条中的三代头孢菌素或氨曲南的MIC≥2μg/ml即可疑为ESBLS。（5）仪器测定法：Vitek,microscan和BD-PHOEMXTM微生物分析仪均可测试ESBLS。（6）利用分子生物学技术（PCR、DNA探针等）及分析酶底物谱及抑制物谱、生物化学技术等检测技术可对ESBLS做出确诊。三、Ampc酶检测1.初筛：（1）头孢西汀（30μg/片）与头孢西汀（30μg）/邻氯西林（200μg）。后者比前者的抑菌圈≥5mm即疑为Ampc。（2）5种纸片筛选：马斯平、泰能、头孢西汀、头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸。如头孢西汀≤18mm，对马斯平、泰能敏感即疑为产Ampc，如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈≥5mm可能产ESBLS。2.确认试验（头孢西汀三维水相试验法）AmpC酶新的检测方法3.三维水相试验方法的改进（1）将标准菌株ATCC25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片)纸片，在距纸片边缘1cm处，用无菌手术刀片切3cm长度的小槽，将待测菌株的6个菌落接种于槽内(勿溢出槽外)，35℃孵育18-24h。（3）结果观察：若抑菌圈向内凹陷，即AmpC酶阳性。※三维水相试验方法的改进(M-H平板打孔[2mm]扩散法).AmpC酶新的检测方法4.质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测（1）将标准菌株ATCC25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片)纸片，在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含20ul，PH8.0，1MTris-0.1MEDTA）。（3）另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片（同上）。（4）35℃孵育18-24h，如待检菌出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性。四、金属β-内酰胺酶的表型检测方法1.头孢他啶+2-巯基丙酸法(CAZ+NCA)（1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板上分别贴两片头孢他啶(30ug/片)纸片，纸片中心相距2.5cm,将其中一片头孢他啶纸片上加3ul2-巯基丙酸，35℃孵育18-24h。（3）结果观察：若加有2-巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大于单个头孢他啶的抑菌圈（≧4mm），则为阳性，即产金属β-内酰胺酶。金属β-内酰胺酶的表型检测方法2.亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA)（1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片)纸片，在距亚胺培南纸片中心1.5cm处贴无菌空白纸片一片，将0.5MEDTA10ul均匀浸注于空白纸片上，35℃孵育18-24h。（3）结果观察：若两片纸片抑菌圈有协同作用，则为阳性，即产金属β-内酰胺酶。五、肠杆菌科碳青霉烯霉筛选和确证（2009年CLSI:M100-S19.APPB.124）1.如果菌株对碳青霉烯类药物表现为“I”或“R”没必要再去检验该酶，（医生通常不会选用“I”或“R”的药物），但主要以感染控制为目的检验该酶。2.什么是碳青霉烯酶？一类能水解或灭活碳青霉烯类抗生素的酶，如：KPC（肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶）.•碳青霉烯类抗生素－Doripenem（目前无CLSI折点）－厄他培南－亚胺培南－美洛培南3.肠杆菌科碳青霉烯敏感及碳青霉烯酶筛选的折点＊亚胺培南不用于变形/普罗威登/摩根菌属中碳青霉烯酶的筛选。因为这些菌属会产生非碳青霉烯酶导致的亚胺培南MIC升高。＊＊NA：不可用（本试验不适用于筛查）4.什么时候做改良Hodge试验？•如果头孢噻肟、头孢他啶和/或头孢曲松全部“R”。•注：头孢比肟对于碳青霉烯酶产生株的结果是不稳定的。•MIC（μg/ml)抑菌圈(mm)•厄他培南219-21•亚胺培南＊2-4NA＊＊•美洛培南2-416-215.做改良的Hodge试验（确证试验）（1）ATCC25922配成0.5麦氏浊度，1：10稀释。（2）用棉签满涂布于MH平板上，就像纸片扩散法药敏试验一样，在中心加一张厄他培南或美洛培南（最好）纸片。（3）取待测菌（1－3号）从纸片边缘向外划（用1μl接种环）。（4）35℃培养过夜后，观察结果。（5）大肠沿着菌株划线的生长表明碳青霉烯水解酶的产生。6.改良的Hodge试验：检测碳青霉烯酶活性的表型试验，在检测KPC方面有90％的敏感性/特异性，检测其他碳青霉烯酶时敏感性/特异性不定（如：低水平的金属酶）。7.改良Hodge试验的质量控制(2009年CLSI:M100-S19.APPB.124)：随患者菌株每天检测。（1）改良Hodge试验阳性菌株:肺克ATCCBAA-1705（2）改良Hodge试验阴性菌株：肺克ATCCBAA-1706六、D-Test试验（1）将待检菌按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平上板贴一片红霉素(15ug/片)纸片，在距纸片边缘1.5cm处贴克林霉素(2ug/片)纸片。（3）35℃孵育18-24h，如克林霉素出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性。D-Test试验耐药表型判断耐药机制红霉素克林霉素基因型―――――――――――――――――――――――泵出(MS)RSMSRA核糖体基因诱导变异(iMls)RD-Test(+)（ermC为主）核糖体基因结构变异(cMLS)RR（ermA为主）―――――――――――――――――――――－－七、其它耐药表型检测1.MRSA，MRCNS2.VRE3.PRP4.泵出机制：美平/泰能（MIC）≥1附：鉴定卡他球菌方法1.40%KNO3浸湿滤纸条，贴于羊(马)血平板上，周围点种待测菌，如果菌落周围出现大的绿色环，即为阳性。2.丁酸酯酶检测法：购买丁酸酯酶检测纸片(梅里埃公司生产)，涂细菌于纸片上，如几分钟内出现绿色为阳性。