磷脂脂肪酸提取

磷脂脂肪酸分析实验原理：磷脂脂肪酸是几乎所有活体细胞膜的主要成分，周转速率快且随细胞死亡而迅速降解，脂肪酸结构与种类多样，对环境因素敏感，分析结果重复性较好。目前已发现的磷脂物质有1000多种。依据极性有强到弱，磷脂可分为磷脂脂肪酸、糖脂脂肪酸和中性脂肪酸。脂肪酸通常被分为6类，直链顺单烯（cis-）、直链反单烯（tran-）、支链饱和、环状及多烯脂肪酸。脂肪酸经甲酯化后形成脂肪酸甲酯（FAMEs），它们又可分为：羟基取代的FAMEs；酯连接羟基取代的FAMEs；非酯连接羟基取代FAMEs；饱和FAMEs；单不饱和FAMEs；酯连接多聚不饱和FAMEs；非酯连接不饱和FAMEs。仪器及设备气相色谱、MIDI软件数据库、氮吹仪、固相萃取装置、通风橱、离心机、离心管（Teflon盖子），试管（Teflon衬垫）、移液管、SPE硅胶柱（6ml），高纯氮气，一次性吸管，水浴锅试剂柠檬酸缓冲液：柠檬酸3.75g，柠檬酸钠4.41g，用蒸馏水定容至100ml。甲醇、氯仿、盐酸、丙酮、氢氧化钠、正己烷、甲基叔丁基醚(HPLC级)试剂1皂化试剂氢氧化钠45.0gm甲醇(HPLC级)150.0ml蒸馏水150.0ml试剂2甲基化作用试剂:6N盐酸325.0ml甲醇275.0ml试剂3抽提溶剂:正己烷(HPLC级)200.0ml甲基特丁醚(HPLC级)200.0ml试剂4洗脱液氢氧化钠10.80gm蒸馏水900.00ml实验步骤：1、称取2g新鲜土壤于50ml离心管，加入12ml提取液（甲醇:氯仿:柠檬酸缓冲液=2:1:0.8=6.3:3.2:2.5ml）（在加入过程中会有机无机发生分层，建议分别加入），涡旋振荡1min，然后室温下往复式振荡2h，静止10min。2、室温下5000rpm离心10min，上清转入分液漏斗。3、再加10ml提取液于离心管（甲醇:氯仿:柠檬酸缓冲液=2:1:0.8=5.3:2.6:2.1ml），涡旋振荡1min，然后室温下往复式振荡30min，静止10min。4、室温下5000rpm离心10min，上清转入分液漏斗，两次上清合并。5、分液漏斗中加入氯仿5.8ml和柠檬酸缓冲液5.8ml，振荡1min，静止约1h，将下层转入另一收集管，置于50℃水浴，用氮气吹干。然后再加入2ml氯仿，在50℃水浴中用氮气吹干。样品置于-20℃保存。6、把硅胶柱放置在固相萃取装置上，用5ml氯仿预洗脱柱子后，用收集管中加3×0.5ml氯仿溶解样品，并转移到SPE萃取，然后分三次加入20ml丙酮，弃掉洗脱液。再分两次加入甲醇12ml，收集含PLFA的洗脱液。在50℃水浴中用氮气吹干。6、皂化：加入1ml试剂1（NaOH:甲醇:蒸馏水=45g:150ml:150ml）。涡旋振荡5-10秒，盖紧盖子，置沸水浴中5min，然后振荡5-10s，再置于沸水浴中25min。取出后用自来水冷却。8、甲基化：加入2ml试剂2（6NHCl:甲醇=325ml:275ml），涡旋振荡5-10秒。盖紧盖子于80±1℃加热保温10±1min。用自来水冷却。9、萃取：分三次加入9ml试剂3（正己烷:甲基叔丁基醚=200ml:200ml），振荡以提取PLFA甲酯（振荡时间稍长10min）。用滴管吸取上层正己烷相于另一干净试管，注意不要吸入杂质层和下层水相。10、基本洗涤：加入3.0±0.21ml试剂4（NaOH:水=10.8g:900ml），盖紧盖子温和地旋转振荡试管5min，2000rpm离心3min。转移上层溶液。11、浓缩收集液至适当体积，将PLFA甲酯转移到自动上样器小瓶。备注：1）各溶剂沸点：氯仿61.3℃；甲醇64.7℃；正己烷68.7℃；甲基叔丁基醚55.2℃。2）酯化样品中加入13:0与19:0甲基酯或者16:0与24:0甲基酯作内标。影响PLFA提取效率的因素：1）甲醇与土壤比例至关重要2）缓冲液与相应pH值。如用酸性柠檬酸代替中性磷酸盐缓冲液提取酸性有机质土壤，可提高磷脂回收率且避免无机磷污染；又如，C14-C20PLFAs在没有其他成分保护时会氧化而迅速降解，提高酸度可延迟酸败。3）盛放磷脂的玻璃器皿应用10%HCl浸泡后，于450℃烘4h或400℃过夜去除磷脂污染。4）硅胶应绝对避免与水等强极性介质接触，使用前应在120℃活化2h。5）整个提取过程应尽量在避光、低温（＜35℃）条件下完成。19:0脂肪酸甲醋为内标,在甲基化之前加入表1表征微生物的PLFA：微生物类型磷脂脂肪酸标记细菌含有以酯链与甘油相连的饱和或单不饱和脂肪酸（如15:0、i15:0、a15:0、16:0、i16:0、16:1ω5、16:1ω9、16:1ω7t、17:0、i17:0、a17:0、cy17:0、18:1ω5、18:1ω7、18:1ω7t、i19:0、a19:0、cy19:0）革兰氏阳性菌含有多种分枝脂肪酸革兰氏阴性菌含有多种羟基脂肪酸厌氧细菌cy17:0、cy19:0、好氧细菌16:1ω7、16:1ω7t、18:1ω7t硫酸盐还原细菌10Me16:0、i17:1ω7、17:1ω6甲烷氧化菌16:1ω8c、16:1ω8t、16:1ω5c、18:1ω8c、18:18t、18:1ω6c嗜压/嗜冷细菌20:5、20:6黄杆菌i17:1ω7芽孢杆菌各种支链脂肪酸放线菌10Me16:0、10Me17:0、10Me18:0等真菌含有特有的磷脂脂肪酸（18:1ω9、18:2ω6、、18:3ω6、18:3ω3）蓝细菌含有多不饱和脂肪酸（如18:2ω6）微藻类16:3ω3原生动物20:3ω6、20:4ω6脱硫细菌cy18:0（ω7,8）硫细菌i17:1ω5、10Me18:1ω6、11Me18:1ω6脱硫弧菌i17:1ω7c、i15:1ω7c、i19:1ω7c脱硫叶菌17:1ω6、15:11)i、a、cy和Me分别表示异、反异、环丙基和甲基分枝脂肪酸；ω、c和t分别表示脂肪端、顺式空间构造和反式空间构造PLFA的优缺点：优点：（1）检测环境样品中微生物群落时，可避免由培养和直接计数方法引起的问题。（2）不仅可用于检测土壤样品，还可用于检测沉积物、水和腐殖质中的微生物多样性。（3）相对容易且能快速处理大量样品（4）与传统方法相比，能更精确地测定微生物的生物量（5）PLFA图谱包含了磷脂结构的详细信息，可利用这些信息研究微生物群落结构和微生物的代谢条件。缺点：（1）尚未确立土样中所有生物的特征脂肪酸，并且在很多情况下，还无法完全确定土样中某些特定脂肪酸和特定微生物或微生物群落的对应关系。细菌和真菌产生完全不同量的PLFA，脂肪酸的类型及含量可能随生长条件和环境污染情而变化。（2）PLFA方法不能在菌种和菌株水平鉴别出微生物的种类。（3）古菌不能使用PLFA图谱进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是以酯键的形式出现。（4）在一些储存样品的研究中，发现平板计数结果稳定增加，而PLFA测定的生物量却保持不变。这种现象目前还没有令人满意的解释，可能存在着PLFA技术无法反映而平板技术却可以反映群落变化或其他现象（如数量增加，生理变化等）。参考文献：