秦川牛的双肌臀基因敲除

姓名：朱秀生学号：1418302029专业：动物遗传育种与繁殖苏太猪功能基因及其设计实验应用于经济性状的研究摘要：苏太猪是我国本地培育的一个优良品种，它具有产仔多、生长速度快、瘦肉率高、耐粗饲、肉质鲜美等优点。本文主要简单介绍下苏太猪的经济性状和基因的关系然后用一定的分析方法对这些基因的位点进行检测，为今后的苏太猪育种提供一定的根据。关键词：苏太猪；PCR-RFLP；屠体和肉质性状；候选基因1.苏太猪简介随着生活水平的提高，人们对猪肉品质的要求越来越高，肉色、PH值、系水力、肌肉脂肪和适口性等都是影响猪肉品质的重要指标，并且早在1999年就被美国国家猪肉生产委员会认定为“有重要经济价值的肉品性状”[1]。随着生物技术的发展尤其是分子生物学技术的快速发展，使得人们可以在DNA水平上操控这些性状的基因，进而采取标记选择辅助的方法达到是肉质和肉量同步提高的目的。苏太猪是江苏省苏州市太湖猪育种中心培育而成。1991，培育中心以太湖猪为母本，杜洛克猪为父本进行杂交，得到含有50%太湖猪血统和50%杜洛克猪血统的杂交猪。采用群体继代选育法，横交固定，1年1个世代。个世代。至1995年达4个世代，作为一个新品系(D7)通过农业部验收。1999年3月通过国家畜禽品种资源委员会猪品种专业委员会审定为新品种，并改名为苏太猪。“九五”期间被农业部列为重大科技成果推广项目，2000年度被国家列为“农业科技跨越计划”的28个推广项目之一[2]。苏太猪既保持了太湖猪繁殖力强、肉质鲜美等特点，又具备了瘦肉率高、生长速度快等瘦肉型猪的明显特征。外部特征为耳中等大，垂向下方，头面有清晰皱纹，嘴中等长而直，部分猪允许有玉鼻，全身被毛黑色偏直。2.猪肉质，生长相关基因研究进展人类基因组计划和分子生物学技术的发展，推动了猪基因图谱的研究进展，使猪的QTL定位研究取得长足的进步，从而为利用分子标记进行数量性状位点的鉴别和定位奠定了坚实的基础。目前，对影响猪的数量性状的QTL的研究己成为国际上的研究重点，并已取得了一定的成效。对QTLs的分析，有很多种方法，比如分离分析法，基因组扫描法和侯选基因法，其中利用侯选基因法进行猪肉质等相关基因的研究取得了很大的进步。下面就简单阐述下猪生长、肉质相关基因的研究进展。2.1与生长性状有关的基因：IGF1和IGF2在神经内分泌轴上，生长激素GH主要是通过工GFs系统而发挥其促生长功能。下面就简单介绍下IGF1和IGF2的功能。2.1.1.1IGF1的作用GH作为神经内分泌生长轴的主体激素，它的作用主要是通过工GF1介导的。GH的分泌和血液中IGF1的浓度的密切相关，也即IGFI成为GH分泌的特异性指示信号，但工GFl的表达量也依赖于GHoIGFI主要与其本身受体即工GF1R结合而发挥其生物学功能。IGFl主要在肝脏中合成，并释放入血液中，通过血循环到达肾，在肾中降解。其它器官如肾、骨等处也可合成IGFI，通过局部的旁分泌和自分泌促进靶细胞的分化与增重。IGF1的作用机制尚不清楚。一般认为肤类激素是通过细胞膜受体而发挥其生物学作用的，但IGF1在胞膜上，而且在细胞内的滑面型内质网和高尔基体等结构中也发现有其特异性的结合位点[3。IGFl又叫生长介素(SWC)，是由70个氨基酸组成的具有内分泌、自分泌及旁分泌特性的单链碱性多肤，分子量为7648.7Da。pIGFl基因由6个外显子和5个内含子组成，全长80kb。Winter.A.K.等于1994年通过连锁分析将猪的IGFI基因定位于第5号染色体的q23-24，并得到了一个线性连锁图谱:Sw1071-IFNG-S0015-MHC-IGFl-Sw995-Sw967【4】。猪pIGFI生物学功能主要包括介导生长激素的促生长作用，促使体脂的合成，乳腺的发育，卵巢的发育，以及促进某些性腺分泌性激素等作用。pIGFI与猪的胚胎以及出生后的生长有着密切关系。IGF1在仔猪初生时含量最高，出生后第1周开始下降，瘦肉型猪血浆中IGF1含量高于脂肪型，断奶前高于断奶后。对猪的试验结果表明，血浆中IGF1水平与体重及增重呈正相关，在这方面已经阐述得比较清楚。IGF1在不同的猪品种中其浓度也有所差异，生长速率快的猪其血浆中的IGFl浓度也高于生长速率慢的猪。IGF1对猪肌肉的生长也有一定的促进作用，主要是因为GH/IGF1轴作用的主要靶组织是肌肉。给猪注射人或牛的IGF1会使猪的肌肉生长加快，且肌肉中总蛋白和总的IGFI-mRNA丰度上升。Gerrard等发现，随着猪日龄的增加，肌肉中IGF1的表达量也增加到出生后的最高水平，但IGF2基因在肌肉中的表达量却下降(P0.05)【5】。2.1.1.2IGF1基因的多态性检测由于胰岛素样生长因子-1是猪肌肉生长的主效因子，且是生长的候选基因，因此有必要对它进行深入的研究。Casas-Carrill【5】等对6头公猪与18头无相关母猪杂交的群体，分析了与GH和IGFI位点连锁的染色体区域对生长与胭体性状的影响。发现在一个公猪家系中IGF1基因型与断奶后日增重存在连锁(LOD值为2.3)，断奶后日增重的假定QTL所在区间要大于IGF1至Sw1071的范围。因此需要建立几个较大的参考群来进行研究，以确定是否为生长的主要候选基因，还是一种遗传标记。方美英等【6】对我国6个地方猪种的基因频率进行了研究，结果表明香猪除与桃源猪基因频率差异不显著之外，与其它4个猪种(民猪、桃源猪、内江猪、姜曲海猪)之间基因频率差异极显著((P0.0l)，而其它4个猪种之间差异均不显著。王文君等用PCR-RFLP法对南昌白猪(92头)和大约克夏猪(170头)的工GF1基因的多态性进行了研究并分析了不同基因型对个体初生重、2月龄重、4月龄重、6月龄重、料重比、背膘厚和瘦肉率等生产性能的影响。结果表明，在南昌白猪中，AA(等位基因A为151+28bp,B为116十35+28bp)型猪比AB型仔猪初生重高，差异显著((P0.05);在大约克夏猪中，BB型猪比AB型猪的6月龄体重大，差异显著((P0.05),AA型猪比AB型和BB型猪瘦肉率低，差异极差著((P0.01)。周杰等【7】对二花脸猪和大白猪脂肪组织中基因表达量的研究结果表明猪脂肪组织中GHR,IGFI和IGF2R的基因表达有特定的发育模式。IGF1基因表达量的品种差异可能正是两品种猪脂肪沉积规律不同的主要原因之一。李加琪等【8】对216头F2代个体的长白X蓝塘猪资源群应用PCR-RFLP方法检测了工GF1基因的多态性，结果表明IGF1基因不同基因型对断奶后日增重、骨率、月同体瘦肉量和皮脂率等4个性状有显著的遗传影响。2.1.2.1IGF2基因的作用胰岛素样生长因子2是胰岛素一胰岛素样生长因子一释放生长因子家族的成员之一，与有促进有丝分裂活性作用的胰岛素在结构上具有高度同源性。其生物活性受IGF1受体、IGF2受体、胰岛素受体、6个IGF结合蛋白(IGFbindingproteins,IGFBPI-IGFBP6)以及其它激素和营养的调控。IGF2是生长激素发挥作用的中间信使，即生长激素首先作用于IGF2，再由IGF2作用于靶器官，进而发挥促进生长发育的作用。2.1.2.2IGF2基因的结构特点、定位Nezer【9】最早把IGF2基因定位到乓SC2p上。AnderssonL等第一次利用大白猪和欧洲野公猪以及大白猪和皮特兰猪杂交建立的参考家系，收集所有F2代个体表型性状资料，表型性状包括生长性状、月同体性状和肌肉品质等，通过250个遗传标记的基因组扫描，鉴定了几个重要经济性状的QTL。其中，影响肌肉含量和脂肪沉积的QTL定位在猪2号染色体短臂末端((SS.C2p)。Andersson等分析欧洲野猪与大约克杂交后代的资料，将一个对骨骼肌和心肌重量有中等效应的QTL定位于2号染色体，与IGF2基因共线性。deKoning等同样观察到了影响肌肉含量和脂肪沉积的印迹QTL存在于SSC2P。AmargerV等研究认为猪IGF2基因全长约23.8kb，包含共4个启动子、10个外显子，同时含有5，端和3，端非翻译序列。IGF2存在着具有时空特异性表达的启动子。2.1.2.3IGF2基因的多态性研究IGF2是常染色体上的母源印迹基因，由于在肌纤维形成中起重要作用，所以IGF2被认为是影响瘦肉率和脂肪沉积的主要候选基因。Jeon在研究欧洲野公猪X大白猪参考家系的实验中发现猪工GF2微卫星位点Swc9具有高度多态性。通过连锁分析确定了IGF2内含子2中有一个单核营酸多态(G-A转换)，但这一转换所引起的NciI限制性酶切位点改变的作用未被确证;并且发现猪IGF2基因的编码区域的多态性不能解释观察到的QTL效应。目前己发现IGF2基因8个内含子中有3个(第2,3,8内含子)与基因表达调控有关。近年来发现该基因内含子突变与肌肉、脂肪的沉积密切相关。刘桂兰等采用PCR-RFLP技术，分析了工GF2基因第8内含子部分片段在猪资源家系群体中的NciI酶切片段多态性分布，发现IGF2基因该片段的两个Ncil酶切位点在资源家系中均具有多态性。IGF2基因B位点酶切未突变个体均比酶切突变的个体背膘薄18.28%(P0.O1)，肥肉率低22.43%(P0.O1)，瘦肉率高8.71(P0.0l)，位点A具有相同的影响趋势。3.分子育种方法选育苏太猪3.1分子标记育种方法简介传统的数量遗传学育种方法，虽给家畜育种带来巨大发展，但存在周期长、选择，效应小且不稳定的缺点，这些缺点延缓了家畜改良的速度。而基于分子遗传学和分子数量遗传学的分子育种技术的兴起有可能克服这些缺点而给家畜育种工作带来一场革命，大大加快育种进度。传统的数量遗传学育种技术是根据个体及其亲属的表型值通过选择进行的，它只能有效地利用具有加性效应的基因座位，对具有互作和上位效应的一些基因座位则无能为力，而分子标记技术则可以利用一切有利的基因座位来改良动物的生产性状，同时能作到真正的基因型选择，大大提高了选择的准确性和育种效率。分子标记育种即通过DNA标记技术对某些重要生产性状直接进行选择改良。DNA标记技术分为三大类:一是以分子杂交为基础的DNA标记技术，包括基因组DNA限制性酶切、电泳分离、Southern转移与异性探针杂交检测基因组的RFLPs。另一类是以PCR为基础的DNA标记技术，包括RFLP,RAPD,AFLP,DNA扩增指纹(DNA)、SSCP，SSR，SNP、引物判别PCR(AP-PCR)等。第三类是卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA分析。3..2分子标记辅助选择标记辅助选择是将现代分子生物技术与常规育种方法相结合，借助分子标记选择某一位点来改变该位点的基因频率的过程，也称分子辅助选择。3.3PCR-RFLPs原理及在猪育种中的应用限制性片段长度多态性(RestrictionfragmentlengthpolymorpHisms,RFLPs)标记是20世纪70年代中期发展起来的一种分子标记，属于第一代分子标记，并最早应用于人类基因组的研究。和其他分子生物学技术手段相结合，RFLP在动物的遗传育种上的应用日益广泛。3.3.1RFLPs的原理生物基因组中，DNA分子的碱基序列(除突变外)是稳定遗传的，在个体一生中和上下代传递过程中保持不变。DNA限制性酶可以识别并切割DNA特定碱基序列，并生成一定长度的DNA片段。因此，对某一个体或者基因型而言，由限制性内切酶切割而成的限制性DNA片段的长度也是固定不变的。突变型由于任何一个碱基的替代、DNA序列的插入或者缺失都影响包含该序列的DNA限制性酶切片段的长度。但在不同的个体或者群体间，酶切片段的长度却是呈现不同的多态性。这种多态性即称为DNA限制性片段长度多态性(RFLP)oRFLP的这种多态性可以通过电泳和分子杂交技术而实现。RFLP一般有两类，一类是碱基替换(也称点多态性)，另一类是结构变异型;前者由于识别位点上发生了单个碱基替换，使原有酶切位点丧失或者获得新的位点；而后者是由于DNA序列内部发生较大片段的缺失、重复或者插入以及酶切位点