第12章分子研究技术

第12章分子生物学技术一、名词解释1.分子克隆2.载体3.转化4.感染5.基因工程6.转导7.转染8.DNA变性9.DNA复性10.退火11.筑巢PCR12.原位PCR13.定量PCR14.基因打靶15.DNA芯片16.反义核酸技术17.核酸探针二、填空题1．DNA重组技术也称为（）或分子克隆。最终目的是（）。典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤：①提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上即（），形成一个新的重组DNA分子。②将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为（）。③对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。④对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。2．PCR的反应体系要具有以下条件：a、与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的（）。b、具有热稳定性的酶如：（）。c、（）d、（）3．PCR的基本反应过程包括：（）、（）、（）三个阶段。4．转基因动物的基本过程通常包括：①将克隆的外源基因导入到一个受精卵或胚胎干细胞的细胞核中；②（）；③完成胚胎发育，生长为后代并带有外源基因；④（）。5．限制性内切酶的切割方式有三种类型分别是（）、（）、（）。6．质粒DNA具有三种不同的构型分别是：（）、（）、（）。在电泳中最前面的是（）。7．外源基因表达系统，主要有（）、（）、（）和（）。8．转基因动物常用的方法有：（）、（）、（）。9基因在某一染色体上的排列叫。确定某一基因在染色体上的位置叫做，常用的方法有：1、2、3、。10．Southernblotting用于鉴别_____。11．在质粒DNA的制备中，用酚或酚-氯仿混合液抽提以除去碱裂解液中残余------------------。12．质粒的复制类型有两种：受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制的称为（），不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制称为（）。三、选择题1．下列限制性内切酶中，哪一类酶起作用时不需要ATP，……A、Ⅰ类B、Ⅱ类C、Ⅲ类D、上述三类答案：B、Ⅱ类2．ECORⅠ限制性内切酶的识别和切割的核苷酸序列为。A、5’-G↓AATTC-3’B、5’-TTT↓AAA-3’3’-CTTAA↑G-3’3’-AAA↑TTT-3’C、5’-AG↓CT-3’D、5’-GGGCC↓C-3’3’-TC↑GA-3’3’-C↑CCGGG-3’考查点：限制性内切酶的切割。课本内容：A为E.CORI的切割位点。B为DraI的切割位点。C为AluI的切割位点。D为ApaI、banⅡ、Bsp1266的切割位点。答案：A3．基因工程生产产品的主要优点为。A、生产方法简单，成本低廉B、能生产较稀少的药用蛋白，满足人类需要C、是利用天然微生物生产的，没有毒性D、A+B+C考查点：基因工程的优越性。答案：D、A+B+C四、是非题1．用pUC质粒作克隆载体克隆DNA时，人们用显色法筛选重组质粒，即在有IPTG和X-gal的平板上，显示白色的菌落含有原始质粒，而显示蓝色的菌落含有重组质粒。（）2．在PCR反应中，对于短的寡核苷酸，退火温度可用下式计算：Tm=2(A+T)+4(G+C)。（）五、简答题1.基因敲除的基本程序？2.DNA芯片的原理？3.PCR的反应条件？4.分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？5.蓝-白筛选的原理？6.SANGER双脱氧链终止法的原理？7.核酸分子杂交的原理？8.影响杂交的因素？9.探针的种类和优缺点？10.探针的标记法？11.PCR的基本原理？12.PCR引物设计的基本要求？13.对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？14.基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。15.简单说明有那些方法可以得到所需要的基因。16.基因工程载体种类特点？17.基因芯片的原理和方法？18．对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？19．举例说明差示筛选组织特异cDNA的方法？20．杂交瘤细胞系的产生与筛选？21.典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？22.基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。23.说明通过胚胎干细胞获得转基因动物的基本过程？24.什么叫染色体步行法？利用什么原理进行的？简述之。25.若把一个基因亚克隆到载体上去，可能采取怎样的操作步骤？请简要加以描述。六、论述题1．列出5种常用的分子生物学技术并简述各自原理。答案：一、名词解释1.分子克隆：在体外对DNA分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。2.载体：能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。3.转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。4.感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。5.基因工程：有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。6.转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。7.转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。8.DNA变性：在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。9.DNA复性：当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。10.退火：指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。11.筑巢PCR：先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为摸板扩增获取目的基因。可以提高PCR的效率和特异性。12.原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程。13.定量PCR：基因表达涉及的转录水平的研究常需要对mRNA进行定量测定，对此采用的PCR技术就叫定量PCR。14.基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。15.DNA芯片：DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。16.反义核酸技术：是通过合成一种短链且与DNA或RNA互补的，以DNA或RNA为目标抑制翻译的反义分子，干扰目的基因的转录、剪接、转运、翻译等过程的技术。17.核酸探针：探针是指能与某种大分子发生特异性相互作用，并在相互作用之后可以检测出来的生物大分子。核酸探针是指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段DNA或RNA分子。18.基因工程：基因工程就是在基因水平上对生物体进行操作，改变细胞遗传结构从而使细胞具有更强的某种性能或获得全新功能的技术。19.基因芯片：基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，以基因序列为分析对象的微阵列(microarray)，是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。20.脚印法(footprinting)考查点：功能序列的测定。答案：脚印法是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白在DNA上的结合位点的方法。其原理为：将结合有RNA聚合酶的DNA用限制性内切酶切割，得到一个共同的端点，再将端点的一条链同同位素*标记，用微量的DNaseI部分水解这个DNA复合物，在不受RNA聚合酶覆盖的区域，每个磷酸二酯键都可能遭受DNaseI的攻击。但同一分子上只有少量（1-2个）切点，将所得的片段经碱变性、电泳和放射自显影，就可知道RNA聚合酶在标记链上的覆盖区域的大小，并确定其序列。相关内容：DNA测序的方法及其步骤。21.聚合酶链反应：利用与DNA模板序列的两端互补的一对寡聚核苷酸引物来扩增一段DNA序列。由一种热稳定的DNA聚合酶经过三步反应即变性、引物退火和聚合的循环从两个引物来相对延伸。22.DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。23.考斯质粒：是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS区，与质粒连接构成。24.蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。25.Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’3’外切酶活性。26.锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。27.融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。28.限制性内切酶：限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)是一类能够识别DNA的特异序列并在识别位点剪切双链DNA的核酸内切酶.二、填空题1．基因克隆，把一个生物体中的遗传信息DNA转入另一个生物体，克隆载体，转化。2．DNA引物，TagDNA聚合酶，dNTP，作为模板的目的DNA序列3．变性、退火、延伸。4．②接种后的受精卵或胚胎干细胞移植到雌性的子宫；④利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜，培育新的纯合系。5．（在对称轴5'侧切割产生5'粘端）、（在对称轴3'侧切割产生3'粘端）、（在对称轴处切割产生平段）。6．（SC构型）、（oc构型）、（L构型）。（SC构型）。7．（大肠杆菌）、（酵母）、（昆虫）和（哺乳类细胞表）。8．（逆转录病毒感染法）、（DNA显微注射法）、（胚胎干细胞法）。9．遗传图，基因定位，遗传交换定位法，接合定位法，染色体步行和染色体跳跃法。10．DNA。11．蛋白质12．严紧型质粒，松弛型质粒。三、选择题BAD2．考查点：限制性内切酶的切割。课本内容：A为E.CORI的切割位点。B为DraI的切割位点。C为AluI的切割位点。D为ApaI、banⅡ、Bsp1266的切割位点。答案：A3．基因工程生产产品的主要优点为。A、生产方法简单，成本低廉B、能生产较稀少的药用蛋白，满足人类需要C、是利用天然微生物生产的，没有毒性D、A+B+C考查点：基因工程的优越性。答案：Ｄ、A+B+C四、是非题×√1．用pUC质粒作克隆载体克隆DNA时，人们用显色法筛选重组质粒，即在有IPTG和X-gal的平板上，显示白色的菌落含有原始质粒，而显示蓝色的菌落含有重组质粒。（×）考查点：pUC系列质粒。课本内容：α-互补给pUC系列的载体带来了极大的方便：载体中就没有必要包含3kb以上的β-半乳糖苷酶的编码序列。只要包含lac启动子和操作子以及α肽编码序列再加上宿主菌的lacZM15就行了。此外，为保证质粒的稳定性，宿主菌须是lacIq即lac阻遏蛋白过量表达型。这样，只有在用IPTG诱导时，lac系统才能表达。当pUC系列载体内导入DNA片段时，由于破坏了α肽的阅读框或者引入了转录或翻译的终止信号，阻遏了α肽的表达。因而在IPTG—X-gal平板上不显蓝色。pUC系列载体仍然保留了一个氨苄青霉素抗性基因。答案：非，-。带有重组质粒的军落不显蓝色。相关内容：α-互补的概念。2．在PCR反应中，对于短的寡核苷酸，退火温度可用下式计算：Tm=2(A+T)+4(G+C)。（√）五、简答题1.答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。A、打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。B、胚胎干细胞的体外