第14章圆环病毒科(Circoviridae)

第十四章圆环病毒科(Circoviridae)一、鸡贫血病毒二、猪圆环病毒三、鹦鹉喙羽病病毒主要参考文献ICTV发表的第六次病毒分类报告中，将包括鸡贫血病毒(CAV)、猪圆环病毒(PCV)和鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)在内的3个病毒设立了1个新科，即圆环病毒科，下设1个圆环病毒属。该科病毒是所有已知动物病毒中最小的，病毒粒子直径14～25nm，为20面体对称结构，无囊膜，含有单链负股环状DNA。一、鸡贫血病毒(Chickenanemiavirus)同义名：鸡传染性贫血因子，鸡传染性贫血病毒自1979年日本学者Yuasa等首先报道本病并分离到病原以来，英国、瑞典、德国、加拿大、美国等国家和地区都先后证实了本病的存在，澳大利亚及其它一些欧洲、非洲和亚洲国家通过血清学普查，也发现鸡广泛感染CAV。我国亦分离到了该病原。CAV主要危害2～3周龄以内的雏鸡，以损害造血器官和淋巴器官，引起感染鸡发生再生障碍性贫血和免疫抑制为特征，对养禽业危害严重。1.形态结构CAV无囊膜，平均直径23～25nm，电镜下呈球形或六面体形(见图14-1)。病毒核衣壳由32个结构亚单位组成，分子量约50kDa，基因组长2139个核苷酸，包括3个部分或完全重叠的开放阅读框架(ORF)。序列比较发现，CUX1毒株、两个美国毒株、1个日本毒株和1个澳大利亚毒株间的同源性极高。Todd采用Southernblot分析证明，CAV与PCV和PBFDVDNA没有同源性。病毒复制、转录和翻译的过程为：于感染细胞中，单链DNA先以滚环方式复制成双链复制中间体，再以其中1条链为模板转录成1条非剪接多顺反子mRNA，其上含有3个部分重叠的基因，每个基因都有各自的起始和终止密码子，翻译3种蛋白质，分别称为VP1(500kDa)、VP2(240kDa)和VP3(136kDa)，见图14-2。Todd等用抗每个ORF所编码蛋白质的N端和C端多肽的单克隆抗体证明，所有3个ORF在感染细胞中均可表达。图14-1磷钨酸负染的CAV(横杠=100nm)--自李成图14-2CAV核酸复制、转录和翻译示意图→、□分别代表起始和终止密码子VP1为核衣壳蛋白，就是CsCl密度梯度离心纯化后病毒中可检出的1个分子量为50kDa的主要多肽。VP1N端富含精氨酸，与基因组DNA紧密结合，对DNA有保护功能。以VP1和VP2两种蛋白质制备的单克隆抗体证明，CAV感染的胸腺和骨髓细胞以及MDCC～MSB1(鸡马立克氏病脾脏T淋巴细胞系)细胞中均可表达VP2和VP3，进一步证实CAV除可表达病毒衣壳蛋白VP1外，也可表达VP2和VP3，VP2与病毒的装配有关，VP3为1种称作凋亡素(apoptin)的蛋白质，可诱导CAV感染细胞的凋亡。2.理化学特性CAV在CsCl中的浮密度为133～134g/cm3。CAV抗氯仿、乙醚。耐酸，pH30作用3小时仍稳定。耐热，对70℃60分钟和80℃15分钟作用有抵抗力，但80℃30分钟则部分失活，100℃15分钟完全灭活。对酚敏感，5%酚处理5分钟及次氯酸盐处理可使病毒失去感染性。5%的四价铵化合物、两性皂及邻二氯苯等处理2小时，其感染力不受影响。10%十二烷基硫酸钠37℃处理1小时反略增强CAV的感染力。4.抗原性多克隆抗体交叉免疫荧光试验证明，各个CAV分离毒株的抗原性密切相关，用McAb免疫荧光染色法可区分各毒株间的抗原差异。CAV与PCV和PBFDV没有共同的抗原决定簇。现有资料表明，目前所分离到的CAV毒株，如日本的11个毒株、德国的CUX1株、英国的2个毒株、美国的1个毒株和瑞典的1个毒株等，均为1个血清型。Koch等研究了CAV蛋白质的免疫原性和保护性作用，将编码VP1、VP2和VP3的基因逐一插入杆状病毒载体，在昆虫细胞中表达，将表达产物分别接种鸡，发现不能诱导中和抗体，但用VP1和VP2重组杆状病毒同时感染昆虫细胞所产生的蛋白质接种鸡，可诱导CAV中和抗体，若用VP1、VP2和VP3重组杆状病毒分别感染细胞，其细胞裂解物混合后接种鸡，也不能诱导高水平的CAV中和抗体。中和性单克隆抗体不能与感染VP1或VP2重组病毒的昆虫细胞结合，却可与同时产生VP1和VP2的细胞结合。这说明中和性位点需CAV重组蛋白VP1和VP2同时合成，而不是简单的混合。一般讲，病毒蛋白免疫原性多聚体较单体强，但不能排除病毒粒子中少量VP2与VP1结合构成中和位点的可能性。用CAVVP1、VP2和VP3或VP1、VP2重组杆状病毒共同感染鸡，可从其所产蛋的卵黄中检出CAV中和抗体，CAV攻毒免疫鸡的子代一般不表现特征性临床症状。5.病原性本病毒仅感染鸡，各种品种的鸡易感性相同。所有年龄的鸡对CAV都能感染，出生后数日的雏鸡易感性最高。免疫鸡对CAV有抵抗力。CAV呈水平和经卵垂直感染，亦有经精子传播的报道。易感鸡与带毒鸡、被污染的房屋、工具和人员接触可导致感染。一般认为，CAV的主要感染途径是消化道，其次是呼吸道。垂直感染可能是导致雏鸡出生后不久呈现典型发病，即贫血和造血器官萎缩的主要原因。通过垂直感染暴发该病的报道很多。多数鸡群在母源抗体消失后到产蛋前的生长期感染CAV，并产生抗体，其子代可获得母源抗体保护。而有些鸡在产卵初期感染病毒，短时间内不能产生大量抗体，其后代难以得到母源抗体保护，故被CAV感染后可引起疾病暴发。自然条件下，该病的潜伏期不易弄清，但最早12天可表现临床症状，第3～4周死亡增加。人工感染8天后，可出现贫血和组织病变，第10～14天开始发病，病鸡继而死亡。贫血是该病的特征性变化，病鸡感染后14～16天贫血最严重，血细胞压积为6%～27%。病鸡表现精神沉郁，衰弱，消瘦，体重减轻，喙、肉髯和可视粘膜苍白。血液稀薄，血凝时间延长，红、白细胞数显著减少，可分别下降到109个/L和5×106个/L以下。发病后5～6天病鸡大量死亡，呈急性经过，死亡率通常不超过30%，20～28天后存活的鸡逐渐恢复健康，但若继发细菌、真菌或病毒感染，可加重病情，阻碍康复，死亡增多。本病最特征的剖检病变是骨髓萎缩，常见股骨骨髓呈脂肪色、淡黄色或淡红色。胸腺明显萎缩，重量降低，呈深红褐色，严重时可导致完全退化。随着病鸡年龄的增加，胸腺萎缩比骨髓的病变更容易观察到。法氏囊萎缩不明显，有时重量降低，体积变小，而大多数病鸡法氏囊的外壁呈现半透明状态，能观察到内部的皱襞。病情严重者，可见肝、肾变黄，肿大，质脆。胃肠道和肌肉有点状出血。CAV引起的贫血是1种再生障碍性贫血。Goryo等发现，感染CAV后6～8天鸡骨髓的造血干细胞肿大，核内有嗜酸性包涵体，第12天骨髓内有分裂能力的造血干细胞减少或完全消失，第16天该细胞出现再生，恢复造血。Hoop等用McAb免疫酶组化法检测表明，CAV最初侵害造血干细胞，使之破坏。CAV疾病的另1个特点是引起免疫抑制。大量资料表明，CAV病鸡对细菌和真菌易感性增加，腺病毒、呼肠孤病毒等混合感染的致病性明显增高。CAV感染还可影响某些疫苗的免疫效果，造成鸡马立克氏病、传染性法氏囊病、新城疫、传染性喉气管炎等疫苗的免疫失败。众所周知，胸腺的皮质区细胞在胸腺激素诱导下分化为T淋巴细胞，即胸腺皮质细胞是T细胞的前体细胞，T细胞是在胸腺的皮质区发生和成熟的。Yuasa在研究CAV感染鸡的免疫抑制机理时发现，1日龄雏鸡感染CAV后2周，胸腺衰竭达到高峰，用CAVVP3特异性McAb检查胸腺切片，仅在皮质区发现阳性细胞，超过2周龄的鸡虽然对CAV也易感，但不发病。研究发现，这是由于此阶段胸腺皮质细胞对CAV易感性低的缘故。Jeurissen报道，此阶段未检查到CAV感染细胞，亦未见胸腺衰竭。由此可见，2周龄以下雏鸡T细胞的前体细胞对CAV极为敏感，而T细胞不仅是机体细胞免疫的执行者，对体液免疫也有辅助作用(TH)，所以CAV由于破坏胸腺皮质细胞而造成免疫抑制。Jeurissen等研究了CAV破坏胸腺皮质细胞的机理，他发现接种CAV的SPF鸡胸腺病变严重，而对照鸡胸腺则没有病变。组织学检查发现，胸腺皮质细胞染色质在邻近核膜区凝聚，细胞浆中散布有或多或少的球形电子致密小体，胸腺细胞严重衰竭。该氏认为这种现象是进行性细胞死亡或称凋亡(apoptosis)过程的特性，CAV引起鸡胸腺细胞凋亡并不令人惊奇。Vasconcelos发现鸡传染性法氏囊病病毒诱发的免疫抑制，至少部分是由鸡胸腺细胞凋亡所致。获得性免疫缺陷症所导致的免疫抑制也与病毒诱发的细胞凋亡有关。Noterborn发现，培养的鸡单核细胞在感染CAV的早期，CAV编码蛋白凋亡素随细胞染色质聚集，感染后期，凋亡素形成聚合物，细胞凋亡，细胞DNA断裂。用免疫金电镜研究表明，凋亡素存在于CAV感染的凋亡细胞中。体外培养的鸡淋巴母细胞样T细胞和髓样细胞中，CAV凋亡素的表达诱发了这些细胞的凋亡，这些资料表明凋亡素本身启动了CAV感染细胞凋亡的途径。二、猪圆环病毒(Porcinecircovirus)猪圆环病毒(PCV)首先由Tischer于1974年从PK15猪肾传代细胞系中分离获得。该病毒可长期持续感染PK15细胞，不表现CPE。目前尚未证明PCV能引起猪和其它试验动物发病。血清学调查发现，欧洲和加拿大等国的家养和野生猪群中PCV抗体阳性率最高可达95%。免疫荧光和免疫酶组化法也证明，PCV抗原广泛存在于不同代次的PK15传代、猪源原代、继代细胞以及1日到19日龄的猪体内。然而，PCV在细胞培养物和猪体内广泛存在的生物学作用至今尚未搞清楚。PCV没有固定的表面结构，直径17nm，CsCl浮密度137g/cm3。DNA基因组长17kb。分子量58×102kDa。目前只发现PCV有1个分子量为30kDa的蛋白质。病毒DNA利用宿主细胞的酶自动复制。PCV于PK15细胞中能长期持续感染的原因，主要是不形成CPE。Gills证明，传了9年的PK15细胞在其142和134代培养物中仍存在PCV抗原，其污染来源还不清楚，但试验证明，培养用的血清和其它药品并未被PCV污染，而原代猪细胞往往带毒。这揭示PCV对PK15细胞的污染，可能源于原始猪细胞。Tischer对集中在伯林和德国北部两个地区的屠宰猪群进行血清学调查发现，这些猪的PCV抗体阳性率为77%～95%。试验感染猪3～6个月后血清阳性率与上述结果相似。这说明PCV在猪只集中育肥期间呈水平传播。人工感染试验发现，感染猪分泌的鼻汁和粪便是重要的传染源。三、鹦鹉喙羽病病毒(Psittacinebeakandfeatherdiseasevirus)70年代中期，南太平洋地区的鹦鹉发生了1种称为鹦鹉喙羽病的疾病。本病以羽毛对称性发育不良及脱落为特征，此外还可见喙异常，腭骨坏死，横向或纵向骨折或分层等。经自然发病和实验感染证实，此病的病原为病毒，于羽毛和羽毛囊上皮细胞中发现核内和胞浆内嗜碱性包涵体，羽毛超薄切片中见有晶格状排列的病毒粒子。病毒粒子直径14～17nm，核酸为单链负股环状DNA，长17～20kb，含有3种蛋白质，分子量分别为263～237kDa和159kDa。CsCl浮密度为137g/cm3。鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)具有血凝性，能凝集粉红凤头鹦鹉(Eolophusroseicapillus)、东部长嘴凤头鹦鹉(Cacatuatenuirostris)、葵花凤头鹦鹉(Cacatuagalerita)、米切氏凤头鹦鹉(Cacatualeadbeateri)、甘甘凤头鹦鹉(Callocephalonfimbriatum)、戈芬氏鹦鹉(Cacatuagoffini)以及豚鼠和某些品种鹅的红细胞。PBFDV组织特异性强，营养要求高，体外培养至今未获成功。PBFDV感染宿主范围广泛，现有资料表明，该病毒至少可感染35种以上的鹦鹉鸟类。赛鸽亦可感染此病。血凝和核酸探针杂交试验证明，来源于不同宿主的PBFDV抗原性相似。患病动物临床主要表现为羽毛进行性营养不良、脱落，有时伴有喙变形。PBFDV主要侵害羽毛和羽毛囊上皮细胞，并形成核内和胞浆内包涵体，使细胞变性坏死脱落。严重污染环境，是易感禽的主要传染