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第3章植物组织培养与细胞培养东北大学生物技术研究所3.3植物组织与器官培养3.3.1植物组织培养的定义与分类3.3.2重要概念3.3.3细胞分化和形态建成3.3.4植物组织培养的基本步骤3.3.5植物组织器官培养3.3.6植物组织培养的应用3.3.7人工种子3.3.8植物组织与器官的生物反应器培养3.3.9植物组织与器官培养存在的问题3.3.1植物组织培养的定义与分类1.定义植物组织培养(planttissueculture)是指在无菌条件下,将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如花药组织、胚乳、皮层等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体等培养在人工配制的培养基上,给予适当的培养条件,诱发产生愈伤组织、潜伏芽,或者长成新的完整植株的一种实验技术。其理论基础是细胞的全能性。2.分类根据外植体种类的不同,组织培养可分为:器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。根据培养方法的不同,组织培养可分为:微室培养、平板培养、悬浮培养、液体培养、固体培养等。根据培养的功能性的不同,组织培养可分为:再生体系、离体受精、突变体选择、体细胞杂交等。3.3.2重要概念全能细胞(totipotentcell)愈伤组织(callus)外植体(explantation)继代培养(secondaryculture)胚胎培养(embryoculture)脱分化(dedifferentiation)再分化(redifferentiation)茎尖培养无性繁殖系(clone)器官发生(organogenesis)胚状体(embryoid)•全能细胞(totipotentcell):能够表达生物体基因组的任何一种基因,并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞,进而发育为一个完全相同生物体。•愈伤组织(callus):在离体培养过程中由外植体组织增生的细胞产生的具有分生能力的一团不规则的疏散排列的薄壁细胞。•外植体(explant):从植物体上分离下来的用于离体培养的材料,可以是器官、组织和原生质体等。•继代培养(secondaryculture):更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料(愈伤组织.芽等)。•胚胎培养(embryoculture):包括原胚和成熟胚培养、胚乳培养、胚珠和子房(未授粉或已授粉的)培养,可用于研究胚胎发生以及影响胚生长的因素;用试管受精或幼胚培养可获得种间或属间远缘杂种,因此它也是研究生殖生理的有用方法;胚乳培养是研究胚乳的功能、胚乳与胚的关系,以及获得三倍体植株的一个手段。•脱分化(dedifferentiation):已分化好的细胞在人工诱导条件下,恢复分生能力,回复到分化组织状态的过程。•再分化(redifferentiation):脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程,重新形成各类组织和器官的过程。•茎尖培养:较小的仅带几个叶原基或少量幼叶的茎端部分的培养。通常用1—10mm大小的外植体来加速植物的无性系繁殖。•无性繁殖系(clone):由同一个外植体反复进行继代培养后所得一系列的无性繁殖后代。•器官发生(organogenesis):在组织培养中或悬浮培养中,由培养物到显示有自然的器官形成,如形成芽或根的现象。•胚状体(embryoid):在离体培养过程中产生一种形似胚(具有明显的根端和芽端),功能与胚相同的结构。3.3.3植物细胞分化和形态建成一般植物通过细胞或组织培养达到再生目的要经过两个步骤:(1)培养的植物细胞或组织的脱分化,形成愈伤组织;(2)有新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团,随后又由其分化成不同的器官原基(如根原基、叶原基等)。•脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式:(1)器官发生方式:其中芽和根在愈伤组织的不同部位分别独立形成,具有单极性结构。(2)胚胎发生方式:在愈伤组织表面或内部形成很多胚状体,它们类似于合子胚,具有双极性结构。魔芋胚状体•通过胚状体途径产生再生植株有3个显著优点:(1)在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定芽数目多;(2)胚状体形成的速度快;(3)胚状体结构完整,一旦形成,一般都可以直接萌发形成小植株,因此成苗率高。3.3.4植物组织培养的基本步骤以胡萝卜为例,介绍植物组织培养的一般过程(图解):(1)培养材料的采集(2)培养材料的消毒(3)制备外植体(4)接种和培养(5)组培苗的练苗和移栽花药培养单倍体细胞和胚状体细胞和集合体悬浮培养球形形成胚状体心形期鱼雷期子叶期外植体外植体在培养中直接振荡在培养液中振荡在生长素-营养物琼脂培养基上生长的愈伤组织植物组织培养的一般过程的完整周期图解(1)培养材料的采集组织培养所用的材料非常广泛,可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶,有时也利用花粉粒和花药,其中根尖不易灭菌,一般很少采用。对于木本花卉来说,阔叶树可在一、二年生的枝条上采集,针叶树种多采种子内的子叶或胚轴。草本植物多采集茎尖。在快速繁殖中,最常用的培养材料是茎尖,通常切块在0.5厘米左右,如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分,其长度在0.1毫米以下。(2)培养材料的消毒先将材料用流水冲洗干净,最后一遍用蒸馏水冲洗,再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干,并用消毒刀片切成小块。在无菌坏境中将材料放入70%酒精中浸泡30-60秒。再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01%升汞水中消毒10分钟。取出后用无菌水冲洗三、四次。(3)制备外植体将已消毒的材料,用无菌刀、剪、镊等,在无菌的环境下,剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等,叶片则不需剥皮。然后切成0.2-0.5厘米厚的小片,这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。(4)接种和培养接种:在无菌坏境下,将切好的外植体立即接在培养基上,每瓶接种4-10个。封口:接种后,瓶、管用无菌药棉或盖封口,培养皿用无菌胶带封口。温度:培养基大多应保持在25℃左右,但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。增殖:外植体的增殖是组培的关键阶段,在新梢等形成后为了扩大繁殖系数,需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中,增殖培养基一般在分化培养基上加以改良,以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后,可视情况进行再增殖。根的诱导:继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根,必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得健壮根系。(5)组培苗的练苗和移栽试管苗从无菌以及光照、温度、湿度稳定的环境进入自然环境,必须进行炼苗。一般移植前,先将培养容器打开,于室内自然光照下放3天,然后取出小苗,用自来水把根系上的营养基冲洗干净,再栽入已准备好的基质中,基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫,加强水分管理,保持较高的空气湿度(相对湿度98%左右),但基质不宜过湿,以防烂苗。这是哪个阶段?这是哪个阶段?植物组织培养流程图3.3.5植物组织器官培养1.定义植物组织器官培养就是在植物细胞全能性理论指导下,在组织以及器官水平上开展研究的,其目的是实现植物细胞的全能性以完成植物生命周期的过程。2.愈伤组织诱导(1)愈伤组织形成特点由外植体或单个细胞形成愈伤组织一般要经过3个步骤:启动期(或诱导期)分裂期分化期启动期(或诱导期):是成熟组织在各种刺激因素的诱导作用下细胞内蛋白质及核酸的合成代谢迅速加强的过程。受激作用后分裂前细胞的主要变化有:一是呼吸作用加强,消耗氧量明显增加;二是多聚核糖体的不断增加,到有丝分裂前RNA的含量可增加300%;三是蛋白质合成加快,分裂前细胞内蛋白质的总量增加200%;四是各种与分裂有关的酶活性大大加强。分裂期:其主要特征是:细胞数目增加很大,结构疏松,缺少有组织特征的结构,一般呈现透明状或浅颜色。分化期:停止分裂的细胞发生生理代谢方面的变化,出现了形态和生理功能上的分化,直至出现了分生组织的瘤状结构及维管组织。此时,细胞体积不再减小,呈现的颜色多种多样。(2)愈伤组织的生长及分化(3)影响愈伤组织培养的主要因素外植体:虽然所有植物都有被诱导产生愈伤组织的潜在能力,但是不同的植物种类诱导形成愈伤组织的难易程度差别很大。基本培养基:众多的培养基基本上都可以诱导出愈伤组织,但不同的植物种类、基因型和外植体诱导形成愈伤组织的难易程度不同,对培养基的反应也有差别。激素组合:通常高浓度的生长素和低浓度的激动素有利于愈伤组织的诱导和增殖。其中,2,4-D是诱导愈伤组织最有效的物质。3.举例以番杏的组织培养为例介绍组织器官培养技术:番杏别名洋菠菜,属番杏科番杏属的多年生草本植物。主要以肥厚多汁的嫩茎叶作蔬菜食用,并可全株入药,有凉血、解毒、利尿、消疮疥等的功效。具体方法如下:(1)材料和培养基:番杏果实和幼苗;(1)芽分化培养基:MS+6-BA1.0mg/L(单位下同)+NAA0.1+3.0%蔗糖;(2)诱导愈伤组织与分化培养基:MS+6-BA1.0+2,4-D0.5+3.0%蔗糖;(3)生根培养基:3/4MS+NAA0.1+1.5%蔗糖;(4)继代培养基:MS培养基。以上各培养基加0.7%琼脂,PH5.8。(2)培养条件:培养温度25℃左右,日光灯照明,每天光照10h,光照强度1000~1500lx。(3)无菌苗的获取:将番杏果实在浓硫酸中浸泡约1h,流水冲洗30min。再在超净工作台(图示)内用70%乙醇浸泡2-3min,在无菌滤纸上吸干或酒精灯焰烧干,再用0.1%升汞浸泡10min,无菌水冲洗3-4次,用无菌手术刀轻轻刮去果实被腐蚀的部分,然后将其接种于培养基(3)中,培养1周后种子长出无菌苗(图示)。(4)愈伤组织培养:切取0.5cm长的不带腋芽的茎段,置于(2)号培养基上。3周后,茎段周围出现白色松脆的愈伤组织(图示)。愈伤组织的形成标志着接种外植体的生长状态已脱离分化状态,开始重新恢复分生能力。超净工作台番杏无菌苗番杏愈伤组织(5)继代培养:将愈伤组织在无菌条件下从试管中取出,用无菌水洗净,以镊子和解剖刀剔除附着在愈伤块上的培养基,并用无菌水反复冲洗数次,直至愈伤块上无残留培养基为止。用解剖刀将愈伤块切成数小块,在接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中,再与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天后,三角瓶中的小愈伤块即可逐渐长大,这一过程称作继代培养。通过愈伤组织的继代培养,原来接种的1个番杏茎段组织可繁殖出大量的新接种材料用于分化培养。(6)分化培养:剥离白色松脆的愈伤组织继续置于(2)号培养基上,2月后,部分白色愈伤组织上出现绿色芽点(图示)。随着时间推移,绿色芽点不断膨大,其中部分形成正常绿苗(图示)。带绿色芽点的愈伤组织番杏分化绿苗番杏盆栽苗番杏无菌苗(7)生根培养:剥离绿苗接种到(3)号培养基上诱导生根(图示)。7d后开始陆续出根,3周后可有多条须根形成,生根率达95.7%。(8)炼苗与移栽:移栽前,敞瓶炼苗3-4d,取出洗净后,栽至装有蛭石的塑料杯中,加自来水,杯上罩上玻璃烧杯保湿,4d后昼覆夜敞,2周后可除掉玻璃杯。3周后,试管苗张出新根,再将其移入蛭石与土(2:1)的盆(图示)中。成活率为83.3%。3.3.6植物组织培养的应用1.无性系快速繁殖技术2.获得无病毒植株3.新品种培育4.在遗传、生理生化和病理等研究上的应用5.种质资源的保存6.产业化生产前景1.无性系快速繁殖技术对那些繁殖系数低或很难用种子繁殖的名特珍品种的繁殖实用意义更大,甚至是无可取代。如脱毒苗、新育成、新引进、稀缺育种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖,以比常规育苗方法快数百倍到数万倍的速度扩大繁殖,及时提供大量优质种苗。如野生珍稀兰花属国家二级以上保护植物,野生兰花的组织培养利于保护这些珍稀的植物资源。目前,在国内外已掀起“试管苗”热,如国外在兰花、杜鹃、月季、草莓、苹果、柑桔、石竹、铁线莲、桉树等进行快速繁殖已达到商品化生产;我国近年来已获成功推广的有甘蔗、葡萄、罗汉果、兰花、银杏、水稻、甘蔗、菠萝、香蕉、草莓、月季、菊花、无籽西瓜、栎树、山楂、猕猴桃、雪松
本文标题:第3章植物组织培养与细胞
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