第六章酶

《动物生物化学》授课内容内容第六章酶6.1概述酶（Enzyme）是细胞内加速化学反应的生物催化剂。一、酶的生物学意义：①由细胞产生，一定条件下能催化专一性化学反应的生物大分子。②酶是生物体内各种化学变化的主要参与者，控制着体内物质分解、转化、合成以及能量代谢等所有新陈代谢全过程。③很多疾病是由于酶的功能障碍、缺失、变异而引起。④酶是现代生物技术中不可缺的重要工具。另：生物能量学（bioenergetics）1、自由能（freeenergy）任何物质都具有能量。一种物质转变为另一种物质的过程，也伴随能量的转移。这些可转移的能量就是自由能（G）。热力学第二定律：G=H–S∙T一个体系从高能向低能变化，可放出部分自由能推动自发反应，这是放能过程；反之，环境向这个体系施加能量，推动体系从低能向高能转化，这个过程是吸能过程。ΔG=ΔH–ΔS∙TΔG0为吸能反应ΔG0为放能反应2、能量耦联反应不同的耗能反应与供能反应，通过某种方式在相同的时间和空间内，同时或相继进行，并在能量和物质形态上发生互换关系。这就是偶联关系。在生物酶催化下，反应遵守高效（节约时间、空间和能量）、准确（无干扰）、精密（可调控）原则。二、酶催化特性一般特性1、降低反应活化能、不改变反应平衡点和平衡常数；2、用量少，效率高，反应前后的总量不变；3、加快反应速度，可缩短反应时间。独特特性1、高度专一性酶对底物（Substrate）有严格的选择性。绝对专一性（对底物和反应类型都有严格专一性）2相对专一性（对底物或反应类型的要求不很严格）有键专一性和基团专一性两种。立体专一性（对底物的立体结构有专一性）同分异构体则不能催化，如催化L型分子的酶，一般不催化D型底物分子。2、催化条件温和但要求严格催化条件为常温（20—37℃）、常压（1个大气压）、中性（PH6.3—7.8）、水环境等。生物酶是活性大分子，对环境条件非常敏感、要求严格,否则易失活。凡使蛋白质变性的因素都会直接影响酶活性与催化效率。如：酸碱物质、温度、重金属离子、高压、化学变性剂等，都可影响酶活性（即催化能力）。3.催化效率高，反应严格受控酶促反应高效、快速；分子反复使用（使用后即可恢复原来构象），酶总量保持很低浓度。酶活性大小、浓度、底物浓度、产物数量等，都会受到多种途径严格调控。如：酶的合成调控（基因水平上）、酶的活性调控（蛋白修饰、酶原激活、抑制剂作用）、催化过程调控（变构效应、底物浓度以及环境条件）、反馈调控（产物浓度、辅助因子等环节调控）等，另外还有神经调控、激素调控等途径。三、酶命名与分类有两个系统，习惯命名法以反应底物（S）、反应特点、酶来源命名；系统命名法以底物（S）+反应特点国际酶学委员会（EnzymeCommission,EC）将所有的酶按它们所催化的反应的性质分为六大类。四、酶活力测定1、酶活力与反应速度酶催化化学反应的能力称为酶活力。以反应速度的大小来衡量。速度大，则活力强。反应速度：单位时间内，产生的产物总量或消耗的反应物总量（mol/t）。正常条件下，酶促反应初期的产物浓度与时间呈线性关系，之后随反应的进行，反应速度在不断发生变化。酶的活性大小以反应初速度（线性关系）来表示较合理，并具有可比性。测定时间为0—10分钟，多数为测定产物增加值，并作时间/产物浓度曲线图，3求出直线的斜率即为初速度。2、酶的活力单位定义：标准条件下，一分钟内，将1μmol的底物转化为产物所需的酶量为一个标准国际单位。在实际使用中，常用测定反应初速度后，对应换算成活力单位数。3、比活力定义：每毫克蛋白酶中所具有的酶活力单位数。比活力=酶活力数/蛋白酶重量（mg）纯化倍数=酶制剂的比活力/抽提液比活力回收率=（酶制剂总活力/抽提液总活力）×100%应用:1.某酶在一定条件下，5min内使30mmol底物转变为产物，问该酶的活力（IU）是多少？2.从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，总活力为288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？6．2酶的组成与辅助因子一、酶分类依据酶分子内肽链或亚基多少，则有如下之分：单体酶一条多肽链构成，只有三级结构，多为水解酶类；寡聚酶由两个以上亚基（或称单体）组成聚合物，具有复杂的四级结构。亚基间以非共价键连结，一定条件下可分离；酶蛋白分子量巨大。多酶复合体系几种活性不同、专一性不同的酶相互组合形成的酶复合体。分子量巨大，链式催化；一种酶催化的产物即成为另一种酶催化的反应物。为一种节约时间、空间、能耗（活化能、识别、运输）高效、定向、有序的催化模式。另外，根据酶分子化学成份有单纯酶、结合酶之分：单纯酶酶活性只取决于蛋白质结构的完整性，无辅助因子。结合酶酶分子上带有特殊的辅助因子，酶活性取决于蛋白质结构的完整性和辅助因子的共同作用。全酶=酶蛋白+辅助因子（holoenzyme）(apoenzyme)(cofactor)辅助因子包括三大类：辅酶、辅基、金属离子。4二、辅助因子金属离子是酶和底物联系的“桥梁”；稳定酶蛋白的构象；是酶“活性中心”的部分（多以配位键或离子键连接）。全酶中的辅助因子均为有机小分子。与酶蛋白结合紧密、牢固（多以共价连接），用透析法不能将其除去的辅助因子称为辅基（prostheticgroup）;反之结合疏松，且易于用透析法除去的辅助因子称为辅酶（coenzyme）。但两者间并无严格区别。如：乳酸脱氢酶（辅酶I,NAD）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（辅酶II,NADP）琥珀酸脱氢酶（FAD）乙酰辅酶A羧化酶（生物素，ATP，Mg++）脂酰辅酶A合成酶（辅酶A,CoA）辅助因子的主要作用：①协同酶对底物的专一性识别；②稳定对底物吸付以及中间产物分子构像的稳定性；③协同催化过程,并作为电子、基团的暂时供体或受体等。一种辅助因子可与不同类型酶结合，但功能不同；一种酶只能与一种辅助因子结合成全酶，一般不能有多因子。维生素与辅酶：一类分布极广、功能多样化的辅助因子。有脂溶性和水溶性两类。⑴脂溶性维生素：VA（又称视黄醇）化学成份为一种醇。有两种结构A1、A2，后者只在淡水鱼中存在。结构与β—胡罗卜素有关，一分子胡罗卜素可转化成2分子VA。功能上与视觉有关。感光细胞上中一种感光糖蛋白（视紫红质），由蛋白质和VA构成。感光时VA的构象改变，把光信号转变成分子信号；蛋白质则将分子信号转化成生物信号传递给神经系统，产生感觉。VD化学成份上有两种D2、D3。与胆固醇有共同结构。VD原（无活性）经紫外照射后可激活成D2、D3。动物的皮肤中含有：7—脱氢胆固醇紫外VD3；酵母和麦角中含可转化成VD2的麦角固醇。功能上可促进肠对钙的吸收；促进骨钙的吸收和沉积。VE（生育酚）共有8种不同结构。大量存在于麦胚、苜蓿等植物中。功能上与动物造血机能、肌肉营养、生殖系统发育和性活动有密切关系。5VK有两种K1、K2，属醌类。大量存在于动物肝脏、鱼类、蔬菜类麦麸、大豆类等。肠道有益菌也能大量合成而被肠壁吸收。功能上与血凝有关，促进血液凝固。参与重要的凝血因子的合成，对部分凝血酶原有重要的激活作用⑵水溶性维生素：VC和VB族（含生物素、叶酸、泛酸、烟酰胺等）均是重要的辅基、辅酶。VC（抗坏血酸）具有氧化型和还原型两种，相互间可逆转化。是动物体内不可缺的强还原剂，易于被氧化。抗坏血酸抗坏血酸氧化酶脱氢抗坏血酸（氧化型）2H（还原型）人、猴、豚鼠等的肝脏不能合成VC，必须从食物中获取。新鲜植物中含量丰富。6．3酶结构与功能一、活性中心与必须基团酶分子结构中，与底物识别、结合、并起催化作用的局部空间区域，称为酶分子的活性部位（中心）。活性中心：催化基团(催化)结合基团(识别/结合)不同的活性中心有上述两类不同功能的基团，也可以只有一类基团却同时具有两种功能。这些基团均为氨基酸侧链，在多肽一级结构上并非相邻，但形成酶分子特有空间构象时，这些侧链基团可共同组成特定的局部活性区域，通过次级键维持结构稳定，并发挥功能。构成酶活性中心的基团、维持活性中心功能的中心外部分基团都称为必需基团。酶的辅助因子，往往是活性中心的重要组成之一。功能作用：结合基团：组成结合部位；决定对底物的专一性。催化基团：组成催化部位；决定反应的专一性。二、酶原激活使酶原从无活性到有活性的过程称激活。这一过程实质就是分子活性部位的构建、完善和暴露在分子表面，是具有活性功能的高级空间构象的形成过程。生理意义：①强水解活性的酶类，以酶原形态合成并分泌，可有效保护分泌细胞自身的安全，且合成过程简单化；②酶原激活受激活因子、抑制因子、底物浓度等多重因素调控作用。可精确控制活性酶的数量、总活力大小，是控制代谢速度、方向、强度的重要手段。66．4酶催化机理主要研究酶促反应的发生原因、状态及过程。一、活化能与酶使物质从初始态达到起反应的活化态的过程称为分子活化，这时反应物所增加的能量称为活化能。这样反应分子称为活化分子。化学动力学认为：分子间发生反应时必须相互碰撞。当两个分子都具备一定的活化能时，它们间的碰撞才是有效的，才能发生真正的反应。不同的反应（或分子）要求的活化能不同。酶反应的“中间产物学说”：酶的作用：与反应物分子先行“结合”成一种过渡态物质，它因发生形态变化，而导致反应物分子的活化能降低，使反应的速度更快。但酶本身并不发生性质和结构的改变。反应完毕后则酶从次级中间体上分离出来，并保持原来的结构和特性。中间过渡态物质：它的性质不稳定、存在时间短，易于转化成能量级别更低、性质稳定的物质分子。E+SESPEP+E其中ES、PE就是中间过渡态物质。二、诱导契合学说（针对专一性）锁钥学说（又称刚性学说，立体专一性）底物的结构必须和酶分子结合位点的空间构象具有严格的结构互补，才能被酶分子专一性识别并结合。诱导契合学说（又称柔性学说，相对专一性）底物与酶在识别、结合过程中，存在相互间的柔性诱导作用，通过局部变构，使双方的结构严格互补，促进识别结合的顺利进行。变构后的酶结构，对催化活性极为有利，以促进反应的进行。底物结构对酶催化位点的诱导作用，使其构象发生局部改变（包括邻近效应、定向效应、底物变形效应等），更利于相互结合；当酶分子因局部构象改变，诱导产生对底物分子进行催化反应（包括亲核催化、共价催化、酸碱催化等）。6．5酶促反应动力学研究酶促反应规律以及影响反应的相关因素。一、底物浓度对反应速度的影响酶促反应的底物浓度对反应速度的曲线为双曲线。①在[E]、T、PH条件不变时，[S]很小，则V—[S]成正比；②当[S]很大时，速度的增率减小，曲线形成渐近线关系；7③当速度最大时，[S]再大也不能改变速度，呈现出两者无关的关系。中间产物理论认为：反应速度大小取决于[ES]当[S]低时，部分E与S结合成ES；当[S]增加时，则[ES]增，V也增；当[S]再大时，[ES]可达到最大，则V也最大；[ES]不会随[S]增加而再增加。1913年米歇利斯（Michaelis）等提出反应速度与底物浓度的关系公式。Km的特征：①Km为酶的特征常数。只与酶性质、反应环境有关，与[E]无关。可作为鉴别酶的手段。（Km为ν=Vmax/2时的底物浓度[S]，单位是mol/L）②若一种酶有几种底物，则每种底物对应各有一个Km；Km受反应条件影响而改变（同底物同酶但不同条件下，则Km不同）。③1/Km可近似表示酶对底物亲合力的大小。1/Km越大，则亲合力越大。因为：（1/Km）↑，Km↓，则达到Vmax/2时的[S]↓，E与S的亲合力↑。④Km是判断酶促反应对系统影响强弱的重要依据。当一种酶催化反应时，Km小者说明E、S间的亲和力更大，为该酶主要催化方向；对不同酶催化的复杂的连锁反应中，Km最大者说明E、S间的的亲和力小，速度慢，是整个连锁反应链中的限速酶（限速反应）。米氏方程的应用（推算Km的方法常用“双倒数作图法）通过实验测出一组[S]和ν值后即可算出Km例：要求目标反应达到某一速度ν（=A%×Vmax），则应求出合理的[S]。理论上先求出该反应的Km，则ν=A%×Vm