紫外可见分光光度计

普析通用紫外/可见分光光度计主讲人董韬分光光度法紫外-可见分光光度法从开始到现在，经历了一个漫长的、曲折的过程。分光光度法分光光度法的使用始于牛顿(Newton)。早在1665年牛顿做了一个惊人的实验：他让太阳光透过暗室窗上的小圆孔，在室内形成很细的太阳光束，该光束经棱镜色散后，在墙壁上呈现红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫的色带。这色带就称为“光谱”。牛顿通过这个实验，揭示了太阳光是复合光的事实。1814年德国物理学家J.夫琅和费利用自制光谱装置仔细观察太阳光时，在明亮彩色背景上观察到576条狭细的暗线。其中最明显的8条用A到H字母标记。这就是人们最早知道的吸收光谱线，被称为“夫琅和费线”。分光光度法1859年德国物理学家本生(R．W．Bunsen)和基尔霍夫(G．R．Kirchhoff)发现由食盐发出的黄色谱线的波长和“夫琅和费线”中的D线波长完全一致，才知道一种物质所发射光的波长(或频率)，与它所能吸收的波长(或频率)是一致的。分光光度法朗伯(J．H．Lambert)早在1760年就发现物质对光的吸收与物质的厚度成正比，后被人们称之为朗伯定律；比耳(A.Beer)在1852年又发现物质对光的吸收与物质的浓度成正比，后被人们称之为比耳定律。在应用中．人们把朗伯定律和比耳定律结合起来，称之为朗伯—比耳定律。随后，人们开始重视研究物质对光的吸收，并试图在物质的定性、定量分析方面予以使用。因此，许多科学家开始研究以朗伯—比耳定律为理论基础的仪器装置。紫外-可见分光光度计世界上第一台紫外可见分光光度计(不是商品仪器，很不成熟)在1918年美国国家标准局研制成功。世界上第一台成熟的紫外可见分光光度计商品仪器由美国Beckman公司于1945年推出。从此紫外可见分光光度计开始在各个领域得到飞速发展。紫外-可见分光光度计一般的双光束紫外可见分光光度计，大多只有一个单色器。例如，日本岛津公司的UV-2450、UV-2550，北京普析通用公司的TU—1901、TU—1221。但是，目前国际上最高级的紫外可见分光光度计中，大多数都有两个单色器；如美国P-E公司的S50／S90系列。这些最高级的紫外可见分光光度计仪器的单色光的单色性很好、杂散光很小、分析误差很小、自动化程度很高、操作非常简单。但价格昂贵，如果每台仪器的附件全套配齐，则需8万～10万美元。单色器：将光源发出的光分离成所需要的单色光的器件称为单色器内容提要第一篇原理及应用领域第二篇常用测定方法第三篇影响仪器质量的几个重要指标第一篇紫外/可见分光光度计的原理及应用领域紫外-可见分光光度法概述分光光度法：利用分光装置，将光源产生的连续光分成各种单色光，用分光后的单色光去照射待测物质，研究物质对不同波长的吸收强弱，对待测样品进行定性、定量分析的方法。紫外-可见分光光度法概述在分光光度法中，按照波普区域可分为：红外分光光度法（3X103nm_3X104nm）可见分光光度法（400nm-780nm）紫外分光光度法（200nm-400nm）合称紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法概述光的选择吸收当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部分光会被吸收或被反射，不同的物质对于照射它们的光束的吸收程度是不同的，对某个波长的光吸收强烈，对另外波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选择吸收。物质呈现出特征的颜色，就是它们对可见光中某些特定波长的光线选择吸收的缘故。一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进行吸收物质颜色和吸收光颜色的关系吸收光物质颜色颜色波长(nm)黄绿紫400~450黄蓝450~480橙绿蓝480~490红蓝绿490~500紫红绿500~560紫黄绿560~580蓝黄580~600绿蓝绿600~650蓝绿红650~750电磁波谱图0.01nm0.1nm800nm10µm500µm1cm波长200nm400nm2.5µm25µm1m光谱可区域见γ射线χ射线紫外光光红外光微波无线电波分析分光方法χ射线光度核磁共振γ射线光谱法光谱法紫外光谱法法红外光谱法微波光谱法光谱法1m=104µm=106nm=109ǺUV/VIS/NIR光照射到物质上入射光I0透射光I光程长光源透射率T=I0I检测器朗伯定律（1760年）：物质对光的吸收与物质厚度成正比:A=f(b)比耳定律（1852年）：物质对光的吸收与物质浓度成正比:A=f(c)紫外/可见分光光度计的简单原理：LAMBERT-BEER定律此处T:透射率e:摩尔消光系数l:光程长C:浓度吸收A=log=eCl1T当一束平行的单色光通过某一均匀溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的长度的乘积成正比。成立条件：①单色光②稀溶液A=log—=-logT=eCl=abc吸光度、透过率与浓度的关系（波长、吸收池光程一定）00.20.40.60.8100.511.522.533.54Abs%T浓度1TUV应用领域大学科研院所制药化学电机电力、供气光学金属医疗分析实验室其它大学科研院所制药化学电机电力、供气光学金属医疗分析实验室其它应用领域：涉及化学化工、医疗卫生、冶金地质、食品饮料、农业化肥、畜牧水产、机械制造、计量科学、环保、制药、生物、材料、石油等领域中的科研、教学、生产中的质量控制、原材料和产品检验等各个方面，进行定性分析、定量测定、纯度检查、结构分析、络合物组成及稳定常数测定、动力学研究等等。目前，紫外可见分光光度计已成为全世界历史最优久、使用最多、覆盖面最广的常规分析仪器。UV的测定范围有机化学分析无机化学分析光学测定生物化学分析环境分析色彩測定临床分析有机化学分析无机化学分析光学测定生物化学分析环境分析色彩測定临床分析测定范围：几乎所有的无机元素和在紫外及可见光区有特征吸收的有机物或有机化合物都能用紫外/可见分光光度法进行测定。紫外/可见分光光度计的基本结构光源单色器样品室检测器控制放大电路显示器比色皿光电管（或光电池）放大器单色光显示器单光束紫外/可见分光光度计斩光器单色光光电管（或光电池）放大器反光镜双光束紫外/可见分光光度计比色皿光电管（或光电池）斩光器放大器单色光显示器光电管（或光电池）准双光束紫外/可见分光光度计S1准直镜切尼尔-特纳G单色器结构S2准直镜第二篇紫外/可见分光光度测定的一般方法（一）定量分析一、绝对法基于朗伯-比尔定律A=ebC，当某一物质在一定波长下e（吸收系数，可由已知浓度样品通过测量、计算求得）为一常数，比色皿的光程也是已知，也是一个常数，只要在吸收系数指定的波长处测定样品溶液的吸光度值(OD值)，然后由下式求得该样品溶液的浓度或含量：C=A/eb二、标准对照法在同样条件下，在选定的波长处，分别测定已知浓度标准溶液的吸光度值A标和样品溶液的吸光度值A样，然后由下式求得样品溶液的浓度或含量：C样=A样A标C标三、标准曲线法（包括K因数法）最常用的定量分析方法。即在一定波长（λmax）下测定某物质的标准系列溶液的吸光度作校正曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由校正曲线求得样品溶液的浓度或含量。所配置的标准系列溶液的吸光度应在0.11.5Abs范围内，吸收测定的精密度可达0.5%。注意：UV/Vis的最低检测浓度与吸收系数、仪器噪声、基线平直度、光谱带宽有关。而最高检测浓度则与吸收系数、仪器的杂散光、光谱带宽等有关，吸收系数与光谱带宽有关。杂散光越小，检测上限越高。四、双波长法标准溶液澄清透明，待测样品浑浊或含有一种与吸收峰临近的干扰成分，对待测成分主吸收波长的吸光度有叠加影响，干扰成分随待测成分浓度变化或无法将干扰成分加入标准溶液中，则必须用双波长法扣除这种干扰成分对待测成分吸光度读数的影响。双波长法是以样品溶液本身作参比，用两束单色光λ1和λ2交替照射到同一样品溶液上，仪器自动求得吸光度差值∆A，在一定范围内∆A与溶液浓度成正比，待测样品与标准溶液在同样条件下测定即可定量。双波长法可消除样品溶液的浑浊背景、色度背景，排除临近吸收峰的干扰（包括二波长法、等吸收点法和系数倍率法）。λ1λ2λ1λ2如：核酸（DNA、RNA）的测定(260nm,280nm或230nm,260nm,280nm)也是双波长或三波长测定法。五、多波长法六、多波长多组分定量法七、导数光谱法导数光谱法由于能提高方法的灵敏度，改善方法选择性，有效的消除基体干扰，尤其适合浑浊试样和进行多组分同时测定。八、化学计量学光度法人工神经网络-分光光度法模糊聚类-偏最小二乘光度法小波变换-偏最小二乘法九、固相光度法固相光度法是将有色络合物吸附或萃取在固相（如树脂，泡沫塑料，结晶萘，石蜡等）离子交换树脂上，再在固相进行光度测定。固相光度法是集分离、富集、测试于一体，不仅简化了试验过程，也大大提高了灵敏度和选择性。另外，还有比吸收系数法、示差分光光度法等，因常规测定应用较少，这里不作详细讨论。十、动力学光度法即时间扫描方式测定。是光度计的吸光度（Abs）、透过率（%T）随时间变化的一种动态测量方式。主要用于酶机理研究、酶活性测定、元素分析及化学反应机理的研究等。动力学光度法因其特有的高灵敏度在光度分析中占有重要地位。动力学光度法可分为三种类型：（1）催化动力学光度法，这是最主要的也是最常用的动力学光度法，系利用被测离子催化显色体系的显色反应或褪色反应进行测定，近年来，利用催化反应测定的论文呈现非常明显的上升之势。其测定范围已包括许多过渡金属、贵金属、非金属和无机阴离子。涉及的元素有Ag、Al、AS、Au、Bi、Br、Ca、Cd、Ce、Co、Cr、Cu、Eu、F、Fe、Hg、I、Mn、Mo、Ni、Os、Pb、Pt、Pd、Re、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Sr、Te、Ti、Tl、Th、U、V、Zn等。涉及的阴离子有SCN-、BrO3-、NO2-、NO3-。（2）诱导动力学光度法，系利用某一转化反应来诱导另一转化反应，借以进行光度测定。（3）速差动力学光度法，是利用性质相近的不同离子在同一显色体系中反应速率常数的差异，对其分别进行光度测定。ABSABS(%T)(%T)时间时间（二）定性分析一、利用标准物质定性在相同条件下，用光谱扫描法测定未知物的吸收光谱，与所推断化合物的标准物的吸收光谱进行比较，如果两吸收光谱的形状和吸收峰的数目、位置、拐点等完全一致，就可初步判定未知物与标准物是同一种物质。但要注意，物质不同但光谱相似的特殊情况。二、用波长位置判断有机化合物的生色基团例如，若发现在210∼250nm有强吸收峰，则可能有双键并处在共扼状态。在260nm、300nm、330nm有高强度的吸收带，表示有3∼5个共扼单位，如在270∼300nm之间有弱吸收(e=10∼100)，表示有羟基的存在；在250∼300nm之间有中强度吸收(e=1000∼10000)，表示有笨环存在等。（三）纯度检查主要用于检查对光没有特征吸收的化合物中的具有特征吸收的杂质。如检查乙醇中醛的量，可用蒸馏水作参比，在270∼290nm处测量吸光度，如在280nm处有吸收，表示有醛。双波长或三波长核酸（DNA、RNA）的测定时，根据A260/A280的比值可确定DNA或RNA的纯度。对于DNA，比值为1.6∼1.8之间,RNA比值为1.8∼2.0之间,认为纯度较高。又如四氯化碳中，最主要的杂质是二硫化碳（CS2）。二硫化碳杂质的多少，衡量产品质量的好坏。二硫化碳在紫外区的318nm处有一个很强的吸收峰。因此，只要检查318nm处二硫化碳吸收峰的大小，就可知道四氯化碳产品是否合格。（四）固体样品的分析固体样品分析的配件主要有：积分球、镜面反射装置、固体样品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架等。积分球是利用固体样品的正反射（入射光按以法线为中心的对称角度反射，称镜面反射）或漫反射（入射光向各方向反射）的特性进行分析的装置。镜面反射装置主要用于半导体、光学材料的反射率测试。固体样品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架用于光学玻璃、电泳胶条等的测定。积分球、镜面反射装置是利用光的反射原理进行定性、定量测定。如配备有透射样品池架，也可进行样品溶