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检测步骤:1.取病人血清140µl,加入560µl缓冲液(AVL),在漩涡混合器上振荡混匀,室温静置10min。2.加入560µl无水乙醇终止反应。3.裂解后的液体分两次移入管柱,每次13000r/min离心13000min,此时病毒RNA会吸附在管柱底部的膜上。4.加500µl洗液(AW1)至管柱上,离心机13000r/min离心2min,弃去AW1。5.加500µl洗液(AW2)至管柱上,离心机13000r/min离心2min,弃去AW2。6.进一步离心13000r/min3min以彻底去除残留在膜上乙醇。7.加入60µl洗脱液(AVE),室温静置3-5min。8.将管柱置于1.5mL离心管上,4℃离心14000r/min2min,得到的RNA即可进行RT-PCR检测。9.PCR的扩增在0.2mLPCR反应管中加入下列成分后,加入10µl上述提取的病毒RNA,混匀后稍稍离心,直接置基因扩增仪进行扩增。10×OneStepRNAPCRBuffer5µl25mmol/L氯化镁10µl10mmol/LdNTP5µlRnaseInhibitor(40U/µl)1µlAMV-OprimizedTaq1µlAMVRTaseXL(5U/µl)1µlD1(10μmol/L)2.5µlD2(10μmol/L)2.5µlRnaseFreedH2O12µl反应条件:逆转录50℃45min,PCR反应94℃4min,55℃60s,72℃60s一次,再进行35次循环的94℃35s,55℃35s,72℃35s,最后再以72℃10min结束。结果判定:取2-10µl扩增产物与1-2µl含溴酚蓝的样品缓冲液混合,加到1-2%孔中,用1×TBE作电泳缓冲液进行电泳,电泳完毕后置紫外灯下观察扩增产物
本文标题:病毒血症期病人血清登革病毒I-IV型特异性核酸检测
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