白细胞净化溃疡性结肠炎的新疗法

白细胞净化——溃疡性结肠炎的新疗法LeukocytapheresiswithLeukocyteRemovalFilterasNewTherapyforUlcerativeColitisKojiSawada,Kunikiohnishi,TadashiKosaka,ShinjiChikano,YoshiroYokota,etalTherapeuticapheresis1997;1(3):207-211用白细胞除去滤器的白细胞净化疗法（leukocytapheresis,LCAP）用于多种疾病治疗的有效性已被确定，包括免疫应答紊乱性疾病如类风湿性关节炎、突眼性甲状腺功能亢进症（Graves病）、白塞病及寻常性天疱疮等。溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC）是以来源于循环的炎性细胞，包括单核细胞、淋巴细胞和中性细胞的浸润为特征。若干因素导致炎性细胞在病变局部聚集；这些因素包括在微环境中细胞因子的释放及循环炎性细胞表达的活性表面标志与其在局部靶细胞表达的活性表面标志之间的相互作用。近来研究显示，致炎细胞因子包括IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ分泌增加，诱导在UC肠部炎症的发生，可能起着重要作用。这些细胞因子强力诱导炎症反应和在炎症UC肠黏膜表达单核细胞数量与同外周血一样增多。在最近2年来，我们已经很方便地将LCAP用于治疗难治性UC，现在报告我们的临床研究结果，包括部分已经发表过的资料。观察在LCAP实施之前、实施过程中和实施之后外周血细胞的变化及白细胞的除去率。这个报告客观的评价在LCAP治疗前、治疗过程中和治疗后白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板数（PLT）和白细胞分类百分数的变化，以及在LCAP治疗期间经过白细胞滤器柱前后，人类白细胞抗原HLA-DR+细胞和粘附分子阳性细胞的除去率。我们也报告关于LCAP的疗效和LCAP对UC治疗前后观察的一系列外周白细胞，特别是单核细胞的细胞因子产量，其中涵盖了部分以前的资料。病人和方法主要包括的和除外的标准以前业已发表。纳入本研究的UC病人主要条件为：有活动性摘要：45例溃疡性结肠炎（UC）病人，接受用白细胞除去滤器柱的白细胞净化疗法（LCAP）。评价在LCAP治疗过程中白细胞计数和分类百分数变化，每例病人外周单核细胞的细胞因子产量和用流式细胞仪完成LCAP对活化细胞和粘附分子阳性细胞的除去率。强化LCAP治疗期间45例病人中有35例（77.7%），维持治疗期间有32例（71.1%）见有临床进步。白细胞计数在净化治疗过程中的第1个30分钟减少大约40%；但在LCAP完成后20分钟增加到大约170%。TNF-α浓度，有效组在LCAP治疗前高于无效组和对照组；而在LCAP治疗后减低到接近正常范围。IL-1β、IL-2、IFN-γ和IL-8水平，有效组在LCAP治疗前接近正常上限，在LCAP治疗后均减少；而IL-4浓度在LCAP后增加。在无效组和对照组，以上细胞因子浓度在LCAP治疗开始前，已经或接近正常范围。流式细胞仪研究显示，LCAP对活化的细胞和粘附分子阳性的细胞清除更有效。在LCAP治疗前后临床的改善和观察到的变化，支持LCAP能干预UC的发病机理。临床表现，对常规治疗反应不充分、过敏反应或以前未用药物治疗的病情严重患者，共计45例。其中21例诊断为严重型、15例为中等严重型、9例为轻型。所有病人在进入本治疗前均知情同意。用Plasauto1000净化装置（旭医疗公司产品，日本东京），全血从肘静脉泵出，血流率为50ml/min，甲磺酸奈莫司他抗凝，抗凝血通过白细胞除去滤器柱（Cellsorba，旭化成医疗公司产品，日本东京），然后返回病人。每次治疗净化3000ml全血，每周1次，5周为强化治疗期；然后每2~6周（大体为每4周）进行1次，为维持治疗。记录临床表现作为主观评价指标；例行的常规实验室检查和内镜检查作为客观评价指标。此外，还评价在治疗期间用刀豆素A作为促细胞分裂剂刺激每例病人的单核细胞，观测细胞因子产量，如IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ在培养物上层的产量水平；用脂多糖作为促细胞分裂剂刺激每例病人的单核细胞，观测IL-1β和IL-8在培养物上层的产量水平。我们按照以前应用的标准对LCAP治疗反应进行分类。显著改善：病情缓解，类固醇停用；中等改善：LCAP治疗后病情有进步，但未缓解，类固醇减量，但不能停用；无改善：无变化或恶化。UC的缓解定义为：内镜检查无溃疡、无糜烂、无出血发现，所有症状消退。在LCAP强化治疗末期或维持治疗期间，对任何病人无任何进步，则中断治疗；在强化治疗期间，病情有中等或明显进步的病人，则治疗继续。结果在LCAP实施过程中，所有的病人都能很好耐受，临床和血液学检查任何病例均未见副作用。每次治疗除去白细胞数量平均为1.7×1010，与我们以前的报告相同。在强化治疗期间，45例病人中有35例（77.7%）显示改善，其中包括8例病人显著改善；此外的10例病人病情未见变化。在维持治疗期间45例中有32例（71.1%）显示进步，治疗继续维持；13例未见进步。治疗后没有进步的病人中，8例有作为UC病史一部分的直肠乙状结肠炎中等程度症状超过6年；2例有中等程度症状合并假性息肉的降结肠炎，病史大约5年；1例合并有假性息肉的严重降结肠炎病史约2年；2例有全结肠炎的严重症状，病史不足2年。在LCAP实施前、实施过程中和实施后，观察白细胞计数和分类百分数、红细胞计数和血小板计数的变化。我们发现在治疗开始后的30分钟，白细胞计数较治疗前值减少到40%；然而在LCAP一次治疗结束时回升到治疗前值的70%（图1），在治疗过程中白细胞除去滤器柱的除去能力保持稳定不变（资料未显示）；然后，在LCAP一次治疗结束后20分钟，惊奇地进一步上升到大约为治疗前值的170%（图1）。我们考虑这一现象是自身稳定控制的结果，称为自身稳定控制过度现象。这个增加值在次日即恢复到治疗前值水平（资料未显示）。经滤过柱的白细胞除去率和白细胞计数回升过度现象，在治疗有效组与无效组之间的差异无统计学意义。另一方面，绝大多数红细胞没有除去；仅有35%的血小板在治疗开始后的30分钟被除去，并在这一时点上血小板粘附达到了平衡（图3）。无论红细胞或血小板，都没有自身稳定控制的过度现象。在有效组和无效组的血小板除去率之间的差异无统计学意义。处理3000ml全血，大约有90%的白细胞被用于白细胞除去滤器的材料特征性粘附并选择性除去（图2）。在持续60min的全过程中，白细胞除去滤器的除去效能，与LCAP治疗前后采取血标本测定的白细胞计数进行比较，确定是稳定的。当血液通过滤过柱后，几乎所有的粒细胞（100%）都被除去；但淋巴细胞仅有60%被除去，粒细胞的除去率和淋巴细胞的除去率在有效组与无效组之间比较，差异无显著性。图1UC病人在LCAP治疗前、治疗中及治疗后周围血白细胞计数的变化图示在LCAP过程中白细胞计数的百分率变化。LCAP治疗开始后，白细胞计数逐渐减少，15min减少到开始时的前值70%，30min减少到前值的40%；之后回升，60min治疗结束时回升到前值的70%；治疗结束后20min回升到大约前值的170%。在次日恢复到前值水平（图中未显示）图2在LCAP治疗不同时间有效组与无效组白细胞总数、中性细胞和淋巴细胞数的变化在LCAP治疗15、30、45、60min的白细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞与治疗开始的前值比较，抗凝血通过聚酯纤维无纺布滤过柱时，90%的白细胞被粘附除去，有效组（A）与无效组（B）白细胞除去率比较无统计学意义。几乎100%的中性粒细胞被除去，大约有60%的淋巴细胞被除去，尽管在LCAP过程中不同时间淋巴细胞的除去率有所不同（15min时84%、60min时54%）。中性粒细胞和淋巴细胞的除去率在有效组与无效组两组之间比较无统计学意义。前15min30min45min60min后20min时间前后前后前后前后15min30min45min60min时间前后前后前后前后15min30min45min60min时间有效组白细胞总数中性粒细胞淋巴细胞无效组白细胞总数中性粒细胞淋巴细胞有效组—白细胞无效组—白细胞在有效组与无效组的培养基中，经促有丝分裂剂作用产生的细胞因子浓度进行比较的结果，此前曾报告过（资料未显示）。有效组在LCAP治疗前的TNF-α浓度，较无效组为高；然而在强化治疗和维持治疗后，这一水平减低并接近于正常。在对照组，病人显示反应不良，在治疗前TNF-α在正常范围内或接近正常范围，在治疗期间未见变化。IL-1β、IL-2、IFN-γ和IL-8的浓度，在LCAP治疗前，有效组接近正常上限，而无效组则在比较高的水平。在LCAP治疗后IL-1β、IL-8、IFN-γ浓度减低，有效组在维持治疗后IL-2轻度减低。然而，这些改变在两组之间进行比较，差别无意义。检测IL-6的病例，治疗期间两组的结果未见改变。当在强化治疗和维持治疗后比较IL-4的浓度，仅在有效组见有增高。在对照组，病人显示对LCAP反应不良，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8和IFN-γ水平在LCAP治疗前和治疗过程中，均在正常或接近正常水平。图3在LCAP过程中红细胞数、血小板数与治疗开始时的前值比较百分数变化在LCAP实施过程中红细胞基本没有除去，血小板计数在实施30min时与LCAP开始的前值比较大约减少到65%；但在后30min大体保持在这一水平。在治疗结束后20min，红细胞和血小板计数均有所回升。有报告提示，UC病人活化的白细胞数明显升高。我们的流式细胞仪分析也显示活化的T细胞百分率，例如HLA-DR+、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD8+在治疗开始时增高，但对LCAP治疗有效的病例治疗后减少到接近正常范围；无效的病例开始时接近正常范围，治疗后保持无变化。近来我们注意到活化的细胞如HLA-DR+、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD8+细胞和粘附分子如CD11a和CD11b阳性细胞，较非活化的细胞和粘附分子阴性细胞能更有效地被清除（资料未显示）。讨论尽管还有某些疑义，LCAP疗法对病史相对较短而不管病情轻重的UC病人的治疗是有效的；但似乎是对病史长者无效。对细胞因子产量的评价，在无效组单核细胞致炎性细胞因子的产量较有效组为低。换言之，外周血白细胞，特别是无效组单核细胞未被预处理，而在有效组则被预处理并激活。这一结果显示，与流式细胞仪研究的结果有相似的倾向。流式细胞仪检测结果支持病人肠黏膜的炎症反应已经中止，而临床症状则是由于晚期结肠炎症，例如严重的纤维化导致肠管变形所致。在本研究中，我们已知在持续实施LCAP治疗1h的过程中，白细胞滤过柱的效能没有前15min30min45min60min后20min时间有效组—红细胞无效组—红细胞有效组—血小板无效组—血小板衰减，血液通过白细胞滤过柱的LCAP实施后值与实施前值比较，粒细胞几乎100%被吸附除去；而滤出的白细胞几乎都是淋巴细胞。在全血进入白细胞滤过柱前，具有高百分率的HLA-DR+活化细胞和CD11a及CD11b的粘附分子阳性细胞，当通过白细胞滤器柱后惊人的减少，这也许意味着活化细胞和粘附分子阳性细胞对滤过柱有较高的粘附率。我们发现在LCAP治疗开始后的30min，白细胞计数减少到治疗开始值的大约40%。然后，如果用相同的滤过柱继续进行治疗，粒细胞数逐渐增加。这一现象，我们认为是自身稳定维持控制系统对外周白细胞数量调节的结果。然而，这一现象在LCAP治疗完成后并未停止，甚至外周白细胞继续升高达到治疗前值的170%左右。过多的白细胞在LCAP治疗后的次日，回复到治疗前值水平。对这一现象，我们称之为自身稳定维持控制过度现象。我们推测，对维持自身稳定的白细胞动员，在短时间内（仅在LCAP治疗的30分后）不能来自骨髓；也许是来自血管内滚动的白细胞，包括在炎症损害的局部和在网状内皮系统淋巴结白细胞库的白细胞。我们还推测，白细胞中包括很多炎性细胞作为预备细胞，可以浸润在炎症部位的局部组织；