第四章植物的脱毒与快繁培养

第四章植物的脱毒与快繁培养第一节概念与意义一、概念利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中的病毒，生产健康的繁殖材料。二、植物病毒病简介及危害（一）植物病毒病简介定义：由植物病毒寄生引起的病害。症状：①变色，叶片的叶绿素形成受阻或积聚，从而产生花叶、斑点、环斑、脉带和黄化等。花朵的花青素也可因而改变,使花色变成绿色或杂色等,常见的症状为深绿与浅绿相间的花叶症如烟草花叶病。②坏死，在叶片上常呈现坏死斑、坏死环和脉坏死，在茎、果实和根的表面常出现坏死条等。③畸形，器官变形，如茎间缩短，植株矮化，生长点异常分化形成丛枝或丛簇，叶片的局部细胞变形出现疱斑、卷曲、蕨叶及带化等。（二）病毒的侵染特性①有性生殖退化、仅用无性繁殖方法繁殖的植物，极易受病毒病的侵染。②大多植物病毒不经种子传播（专化性强的病毒除外）。③病毒在生长旺盛的部位繁殖速度慢.（三）植物病毒的危害：已超过500种，随着生产栽培时间的推移，危害越来越严重，发现的病毒种类也越来越多。大多数植物病毒不经种子传播，对于有性生殖退化，仅能用无性繁殖方法繁殖的植物，一旦患病则毫无办法，从而使优良品种的生产力衰退。目前受病毒危害严重影响生产的有：大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉花卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年相当一部分产品要用留作种。如：大蒜：留种量占产量的五到八分之一马铃薯：留种量占产量的十分之一贝母：留种量占产量的三分之一。表1危害园艺植物的病毒数目植物种类染病毒种类植物种类染病毒种类植物种类染病毒种类菊花19矮牵牛5葡萄26康乃馨11马铃薯17樱桃44水仙4大蒜24无花果5唐菖蒲5豌豆15桃23风信子3百合6梨11月季10柑橘23草莓24天竺葵5苹果36病毒的危害给农业生产带来重大的损失，如草莓病毒的危害，曾使日本草莓产量严重降低，品质大大退化，使生产几乎受到灭顶之灾。柑橘的衰退病曾经毁灭了巴西的大部分柑橘，花卉病毒的危害，表现在球极、宿根等花卉的严重退化，致使花小而少，甚至畸形、变色，观赏价值大大下降。三、植物脱毒培养的意义能够有效地保持优良品种的特性；生产无病毒种苗，防止品种退化；快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用；节约耕地，提高农产品的商品率；四、传统的植物脱毒技术简介物理方法：X射线、紫外线、超短波、高温热处理等原理：钝化病毒，从而达到抑制病毒蔓延的目的。化学方法：采用化学抑制剂，干扰病毒在植物体内的复制。生物学方法：选用抗病毒品种或采用种子繁殖方法。传统的防治病毒的方法如物理方法、化学方法及生物学方法防治病毒效果不显著。由于病毒在植物体内分布具有不均匀性，植物生长点附近的病毒浓度很低或无病毒，通过分生组织培养，采取适当的措施，就可以获得脱病毒植株。第二节植物脱毒的原理和技术一、基本原理早在1934年，White发现烟草花叶病毒在烟草根中的分布是不均匀的，越靠根尖（roottip）区病毒含量越低，在根尖的顶端不含病毒。理论假说：(1)能量竞争病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。(2)传导抑制病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。(3)激素抑制在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。(4)酶缺乏1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。(5)抑制因子1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子。二、茎尖培养脱毒法的技术规程1．被脱毒植物携带病毒的诊断：一般根据病毒病的病症特征和表现程度进行判断，必要时可借助指示植物、血清学、分子生物学方法帮助鉴别。2．母体材料的选择和预处理（1）母体材料的选择：①材料应选预脱毒品种的典型性植株，以保证脱毒苗保持原品种的特征特性；②选感病轻，带毒量少的植株；（2）预处理：一般采用热处理。①湿热处理：适用于木本植物的休眠芽。②干热处理：最常用，处理温度一般在50℃以下，根据植物的耐热性和病毒的失活温度而设定。香石竹在38～40℃条件下经两个月处理可除去全部病毒。菊花在35～38℃条件下处理60天可使病毒失活。3．茎尖分生组织培养再生植株外植体消毒——茎尖剥离——茎尖培养——生根培养——植株3.1取样与消毒剪取顶芽梢段3～5cm，削去大叶片，用自来水冲干净，在75%酒精中浸泡30s，用1%-3%次氯酸钠溶液消毒10～20min，最后用无菌水材料冲洗4-5次。3.2剥取茎尖与接种在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全除去病毒。剥离任何可能可能去掉的叶片，但不带叶原基的茎尖分生组织则成苗困难，而分离过大的茎尖分生组织，即分生组织带多个叶原基，则不利脱毒。脱毒时，最好找出茎原基所带叶原基的数目与生长点（茎尖）大小的相关性，这样在取材时就方便多了，茎尖越小对培养基的要求越高，剥离技术要求越高，成功率越低。3.3培养接种后材料置25±2℃，光照度1500～5000lx,每日光照10～16h条件下培养.光照对茎尖培养的影响更大，由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月培养才能成功。一般以White、Morel和MS培养基作为基本培养基，尤其是提高钾盐和铵盐的含量会有利于茎尖的生长。在茎尖培养中，由于操作方便，一般都使用琼脂培养基。3.4生根诱导一些植物茎尖培养形成绿芽后,基部很快发生不定根.而另一些植物茎尖不产生不定根,需经再诱导、生根才能成为完整植株。4．脱毒效果检测主要有指示植物鉴定和血清学鉴定。（1）指示植物：具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。将待侧植物的汁液接种到指示植物上，如果被测植物带毒，则指示植物会出现特定症状。只能定性，不能定量，且受接种方式、发病条件的影响，使鉴定结果出现误差。（2）血清学鉴定：用体外抗原和血清中的抗体所进行的结合反应。血清学鉴定法基本原理当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时，在动物体内会产生一种特异性免疫球蛋白，及抗体。引起形成开题的物质（病毒或异种蛋白）称为“抗原”。抗原和抗体结合，表现为很强的特异性。即由一种病毒产生的抗体只能结合该种病毒，可以在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液中。这种含有特异性“抗体”的血清称为“抗血清”。抗原和抗体相结合的反应称为“血清反应”。抗血清法的局限性：1、不是所有病毒都能制成抗血清。2、病毒在寄主体内含量太少。3、植物体内的单宁物质会与病毒结合，使病毒丧失抗原性质。5、脱毒苗的保存与繁殖一般由科研单位或有条件的种子生产部门进行，作为组织培养繁殖的最基础的材料。无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好地隔离与保存。这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用5~10年。通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目(网眼为0.4～0.5mm大小)的网纱，才可以防止蚜虫的进入。栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。有条件的地方可以到海岛或高岭山地种植保存，那里气候凉爽，虫害少，有利于无病毒材料的生长与繁殖。另一种更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。三、影响脱毒效果的因素①母体材料病毒侵染的程度只被单一病毒侵染的植株脱毒较容易，而复合侵染的植株脱毒较难。②起始培养的茎尖大小一般取不带叶原基的生长点培养脱毒效果最好，带1～2个叶原基的茎尖培养大约可获得40％左右的脱毒苗，而带3个以上的叶原基的茎尖培养一般获得脱毒苗的频率就大大降低。表2茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响茎尖大小/mm叶原基数成苗数脱毒株数脱毒率/％0.121502448.00.272421842.90.6046400③外植体的生理状态一般来讲，顶芽的脱毒效果比侧芽好，生长旺盛季节的芽比休眠或快进入休眠的芽的脱毒效果好。另外还应防止脱毒苗再度感染病毒。（4）培育脱毒苗应用举例：P41-42页。四、其他组织培养脱毒方法（一）愈伤组织培养脱毒通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。感染烟草花叶病毒的愈伤组织经机械分离后，仅有40％的单个细胞含有病毒，即愈伤组织无病毒植株。愈伤组织的某些细胞之所以不带病毒，其理由是：①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；②有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。对病毒侵袭具有抗性的细胞可能与敏感的细胞共同存在于母体组织之中。但是，愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株，并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株。（二）珠心胚培养脱毒:病毒通过维管组织传播，而珠心组织与维管组织没有直接联系。珠心胚：胚珠内的一个或一群珠心细胞发育形成的胚。一般是由胚珠中某些靠近珠孔的核大而细胞质浓厚的珠心细胞形成。珠心胚的形状不整齐,大小不一,而且无胚柄。（三）茎尖嫁接脱毒把极小的茎尖（0.2mm）作为接穗嫁接到实生苗砧木上（种子实生苗不带毒），然后连同砧木一起在培养基上培养，可提高接穗的成活率并脱除病毒。基本原理：植物的分生组织（如根尖、茎尖）不带或很少带有病毒。(四)花药培养脱毒