粘附分子CD11b与ICAM-1在PMNs跨内皮移行中的作用机制研究

1粘附分子CD11b与ICAM-1在PMNs跨内皮移行中的作用机制研究张雪萍刘新波任永功石碧明李亚丽[摘要]目的探讨粘附分子CD11b与ICAM-1在PMNs跨内皮移行中的作用。方法培养原代人脐静脉内皮细胞于3.0μM孔径大小聚碳酸膜上直至其长成单层，然后移入一种48孔两室趋化板内，LPS分别刺激PMN及HUVEC，取其中一部分分别用CD11b单抗、ICAM-1单抗、CD11b＋ICAM-1单抗处理，PMN移行率通过计数跨越内皮细胞的PMNs数决定。结果LPS激活PMNs和HUVECs后，PMN跨内皮移行显著增加(168.77%±3.60%,p0.01).，CD11b单抗和ICAM-1单抗可分别减少这种移行至122.90%±4.65%和114.90%±6.06%。同样，合用两种单抗也近乎产生叠加效应(93.00%±5.21%)。结论粘附分子CD11b与ICAM-1的表达影响着中性粒细胞的跨内皮移行作用，且这两种分子有协同作用。关键词CD11bICAM-1多形核白细胞脐静脉内皮细胞跨内皮移行作者单位：暨南大学医学院附属第二医院深圳人民医院本文受深圳市科技计划项目基金资助编号200204004张雪萍女1969年－博士研究生副主任医师，研究方向：麻醉与危重病医学RolesofadhesionmoleculesCD11bandICAM-1inPMNtransmigratingacross2endothelium.ZHANGXuepingLIUXinboRENYonggongSHIBimingLIYaliDepartmentofAnesthesiology,ShenZhenpeople’sHospital,thesecondsubordinatehospjtalofJiNanMedicalcollege,ShenZhen518020,China[Abstract]ObjectiveToinvestigatetherolesofadhesionmoleculesCD11bandICAM-1inPMNtransmigratingacrossendothelium.MethodHUVECswereculturedongelatintreatedmicroporousmembranesuntilanendothelialcellmonolayerwasgrown.Thentheyweremovedintoa48-welltranswellchamberswithpolycarbonatemembranesof3.0μmporesizesystem.PMNswereisolatedfromfreshheparinizedbloodofhealthyvolunteersbydextransedimentationfollowedbyFicoll-HyPaquegradientcentrifugation.PMNsandHUVECswerestimulatedwithLPS(100ng/ml),thentreatedornotwithCD11bMoAb、ICAM-1MoAb、CD11bMoAb+ICAM-1MoAb.TherateofPMNsmigrationwasmeasuredbydeterminingthenumberofPMNsthroughendothelialcellmonolayers.ResultThereisanincreaseinthenumberofPMNtransmigratingacrossendotheliummonolayerfollowingactivationofthePMNsandHUVECsbyLPS(168.77%±3.60%,p0.01).Pretreatmentwithanti-ICAM-1Aboranti-CD11bAbresultedininhibitionoftransmigrationto122.90%±4.65%and114.90%±6.06%.Whenusedincombination,twoMoAbsinhibitedmigrationinanearlyadditivefashion(93.00%±5.21%).ConclusionTheexpressionofadhesionmoleculesCD11bandICAM-1hadaneffectonPMNtransmigratingacrossendotheliuminanearlyadditivefashion.KeywordsCD11bICAM-1PMNHUVECtransendothelialmigration粘附分子CD11b与ICAM-1在PMNs跨内3皮移行中的作用机制研究在炎性状态下，机体除了产生大量的炎症介质，同时也产生大量的化学趋向物质，在PMN紧密粘附于血管内皮细胞后，趋化PMN穿越内皮细胞，移行至炎症灶内，发挥效应[1]。PMN表面及内皮细胞表面的粘附分子是否也参予并影响着此过程呢？本实验即进行了此方面的研究。材料与方法1微孔滤膜上HUVECs的培养1.1微孔滤膜（华中科技大学同济医学院免疫教研室惠赠）的处理[2]将滤膜浸泡在0.5%醋酸溶液中20分钟，PBS漂洗两遍，置入0.05%明胶溶液中100℃浸泡1小时，吹风机吹干，紫外灯下照射6小时待用。1.2HUVECs的培养[3]将已消毒好的滤膜置入一直径为8cm的无菌平皿，再将已分离的HUVECs以8×105/滤膜的密度接种在滤膜上，于37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时，待其贴壁，转至另一新的平皿，加入含20％胎牛血清、60μg/ml内皮细胞生长因子（ECGF,购自基因公司）、100U/ml青霉素G、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中培养，待其长至单层时用于实验。2PMN的跨内皮移行实验[4]趋化板在使用前充分洗净，干燥并孵至37℃。实验分5组进行，⑴A：正常对照组。⑵B：LPS(100ng/ml)处理组。⑶C：LPS＋CD11b单抗（10μg/ml预处理30min）处理组。⑷D：LPS＋ICAM-1单抗(10μg/ml预处理30min)处理组。⑸E:LPS＋CD11b＋ICAM-1单抗处理组。实验时向趋化板下室各孔中加满0.1μM的fMLP(Sigma公司)，在之上小心覆盖长有HUVECs单层的微孔滤膜，盖上硅胶板和顶板并固定好。再向顶板各孔中加入各组PMN悬液，在37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时，让细胞从膜上向下趋化运动。取下滤膜。用PBS冲洗滤膜毛面，将光面（有迁移细胞）向上置于玻片上，70％甲醇固定，苏木精染色，高倍镜下计数5个视野中的全部细胞，以fMLP的最大趋化细胞数为100％，各组与其相比得到相对百分率。3统计学分析4结果以均数±标准差表示，进行两样本均数t检验，p0.05有显著性差异。结果以fMLP作为趋化PMN的因素，放入趋化板的下室，LPS100ng/ml刺激PMNs及HUVECs后，PMN迁移率明显上升（168.77±3.60vs100,p0.01），分别加入CD11b、ICAM-1单抗后，其迁移率均明显下降（122.90±4.65vs168.77±3.60,114.90±6.06vs168.77±3.60,p0.05）（见图4）,合用两种单抗，抑制迁移的效应出现极显著差异（93.00±5.21vs122.90±4.65,114.90±6.06,p0.01），与任一单个单抗使用组相比，有明显抑制效应的差异。总体结果见表1，图1。表1CD11b、ICAM-1在PMN跨内皮移行中的作用5组别n迁移率（％）A6100B6168.77±3.60＃C3122.90±4.65*D3114.90±6.06*E393.00±5.21*+与对照组相比，#p0.01。与LPS组比，*p0.05。与任一单抗使用组比，+p0.05。图1CD11b及ICAM-1单抗对PMN跨内皮移行的抑制作用与对照组相比，#p0.01。与LPS组比，*p0.05与任一单抗使用组比，+p0.05。020406080100120140160180200对照LPSLPS+CD11bLPS+ICAM-1LPS+CD11b+ICAM-1PMN跨内皮移行率（％）**#***+6讨论正常PMN在一定条件下有缓慢的随机位移，但活化的PMN移动加快，并呈一定的方向性（从化学趋向物质浓度低的的部位向浓度高的部位）移动。炎症状态下，机体产生大量的化学趋向物质，如细菌产物fMLP、C5a及LIB4，诱使已粘附的PMN籍着化学趋向运动，跨过血管内皮移行至损伤部位，发挥其抗炎效应。但如此过程失控，将会对组织产生严重的损伤。已经有大量的研究表明：如同在细胞粘附中所起的作用，粘附分子在中性粒细胞的跨内皮移行中一样不可缺少[5]。但它们是如何起作用、其作用方式又是什么样的，目前还存在许多争论。本研究培养人脐静脉内皮细胞于微孔滤膜上，用48孔趋化板系统检测了PMN及内皮细胞表面比较重要的两种粘附分子CD11b、ICAM-1在PMN跨内皮移行中的作用。ICAM-1是已知的CD11a的配体，以前的研究仅认为它是白细胞－内皮细胞粘附的介质[6]，至于CD11b，认为它并不识别ICAM-1，但后来人们用不同的方法包括用纯化分子及转染细胞的方法证实它同样也是ICAM-1的受体，且两者同样在白细胞的粘附及迁移中扮演着重要的角色[7]。本研究的结果也证实了这一点。从研究结果来看，以fMLP作为趋化因子，LPS组的移行率明显高于对照组，说明在化学趋化因子的存在下，LPS有加强白细胞跨内皮移行的作用。接下来的实验中我们发现，CD11b单抗能明显抑制这种移行作用，ICAM-1单抗的抑制作用程度与CD11b单抗相似，且两者合用有叠加效应，也就是说，同时运用两种单抗于整个实验系统中，它们对PMN跨内皮移行的抑制程度大于单个单抗的抑制程度。我们的实验也同时说明了ICAM-1不仅是白细胞－内皮细胞粘附的介质，它同样也控制着白细胞的跨内皮移行过程。Smith[8]虽然认为CD11b与ICAM-1起着同样重要的作用，但他并不认为两者有协同作用。Furie[9]的研究得出了与本实验相似的结果。有些研究认为，白细胞整合素家族中，在粘附与迁移中起主要作用的是CD11a、CD11b，而CD11c却几乎不产生效应。对于内皮细胞上的配体来说，ICAM-1起着关键的作用，ICAM-2几无作用[9]。但最近的一项研究发现，对于整合素家族来说，CD11a、CD11b共同介导了PMN的跨内皮移行，在它们的配体中，ICAM-2所起的作用与ICAM-1一样不容忽视[10]。从本实验结果分析，CD11b在内皮细胞上的配体除了ICAM-1外，似还存在另一种配7体，该配体还未得到证实，无法用特异的手段阻断该配体以观察其效应。有几个研究提出了此种推断[11]，本研究更加证实了这种看法。目前有关体内的趋化实验还不多，但有限的资料表明化学趋化物质及细胞因子产生的PMN外渗的机制不同[12,13]，象C5a、fMLP、LTB4可以引起PMN的快速外渗，30分钟达到峰值，而IL-1、TNF-α产生的外渗却在1小时左右才出现，而且这种作用能被生物合成的蛋白所阻断，这种现象提示在体内的炎性反应中可能存在蛋白合成依赖性机制及蛋白合成非依赖性机制。正是这两种机制的作用，导致中性粒细胞快速而持续的外渗。本实验系统采用的是双室48孔趋化板，是一种改良的Boyden室系统，传统的Boyden室是单孔小室，由于小室之间的差异，实验误差较大。而本实验的趋化实验装置可以满足快速、准确的需要。总之，在PMN－HUVEC粘附及PMN的跨内皮移行中，粘附分子均起到了重要的作用，且其作用的方式及机制是一致的。8参考文献1．TaylorRF,PriceTH,SchwartzSM,DaleDC.Nertrophil-endothelialcellinteractionsonendothelialmonolayersgrownonmicroporefilters.JCl