第二章培养基

1第二章培养基1.培养基的种类及特点在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部分的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们的生长才能尽如人意。为了满足培养各种组织和器官的需要，已经出现了若干种培养基，如MS培养基、改良White培养基、Miller培养基、Heller培养基、LS培养基、ER培养基、B5培养基SH培养基、Nitsch培养基、N6培养基等，MS培养基特点：是无机盐的浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例也比较适合，也不需要添加更多的有机附加物，这是目前应用最广泛的一种培养基。但它不适合生长缓慢、对无机盐浓度要求较低的植物，尤其不适合过高易发生毒害的植物。改良的White培养基则是一个无机盐浓度较低的培养基。它的使用也很广泛，同时它还非常适合于生根培养和胚胎培养。B5培养基特点是含有较低的铵盐，该营养成分可能对不少培养物的生长有抑制作用，对有些植物如双子叶植物（如豆科植物）特别是木本植物，却更适合生长。N6培养基其KN03和(NH4)2S04含量高且不含钼。目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。SH培养基与B5相似，不用(NH4)2S04而改用NH4H2P04，在不少单子叶和双子叶植物上使用，效果很好。马铃薯简化培养基是为适应经济2条件较差的农村农科站和中学而设计的，既经济又适用，容易取材，有利于组培技术推广和普及。2.培养基的成分目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由水、无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。2.1水分生物的生命活动离不开水分。构成培养基的绝大部分组分为水分。在研究上，常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水。在生产上，为了降低成本，有时也可以用高质量的自来水代替蒸馏水。由于自来水中除了含有大量的钙、镁、氯和其他金属离子外，还含有有机物质。因此，最好将自来水煮沸，经过冷却沉淀后再使用。2.2无机营养物(无机盐)植物所必需的营养元素有16种，包括碳(C)、氢(H)、氧(O)、氮(N)、磷(P)、钾(K)、硫(S)、钙(Ca)、和镁(Mg)、铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、氯(C1)、硼(B)、钼(Mo)，除碳(C)、氢(H)、氧(O)外，其余的都是无机营养元素。无机营养物包括大量元素和微量元素。植物所需元素的浓度大于0.5mmol/L的称大量元素，包括碳(C)、氢(H)、氧(O)、氮(N)、磷(P)、钾(K)、硫(S)、钙(Ca)、和镁(Mg)。它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素。在植物组织培养中,各种营养元素主要从培养3基中获得，氢和氧来自于水，碳来自于在培养基中加入的适当种类与数量的糖,氮(N)、磷(P)、钾(K)、硫(S)、钙(Ca)、镁(Mg)几种矿物元素要靠加入适宜的无机盐类来提供。其中氮常以硝态氮(NO3-)或氨态氮(NH4+)，或两者相互配合的形式存在。镁常以MgS04·7H2O的形式，既提供了镁也提供了硫。硫还有用Na2S04的形式提供，不过其中的钠(Na)对植物并不是必需的，或者说常常是不利的。磷常以NaH2P04·H2O、KH2P04或NH4H2P04的形式提供。钾常以KCl、KNO3或KH2P04形式。钙常以CaCl2·2H2O、Ca(N03)2·4H2O或其无水形式提供。植物所需元素的浓度小于0.5mmol/L的称微量元素，其需要量很少，一般大多为10-5～10-7mmol·L-1，多了会生毒害。培养基中的微量元素主要包括铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、氯(C1)、硼(B)和钼(Mo)等。这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。Fe有两个重要功能，作为酶的重要组成成分和合成叶绿素所必需，缺铁时细胞分裂停止。Mn对糖酵解中的某些酶有活化作用，是三羧酸循环中某些酶和硝酸还原酶的活化剂。B能促进糖的过膜运输，影响植物的有性生殖如花器官的发育和受精作用。B还具有抑制有毒的酚类化合物形成的作用，改善某些植物组织的培养状况，缺硼时细胞分裂停滞，愈伤组织表现出老化现象。Zn是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶4等的活化剂。Cu是细胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影响氧化还原过程。Mo是硝酸还原酶和钼铁蛋白的金属成分。Cl在光合作用的水光解过程中起活化剂的作用，促进氧的释放和还原NADP(辅酶Ⅱ)。为了某些植物组织培养的特殊需要有人还把钠(Na)、镍（Ni)、钴(Co)、碘(I)等也加入微量元素的行列。Na对某些盐生植物、C4植物和景天酸代谢植物是必需的。Ni对尿酸酶(urease)的结构和功能是必需的。但是有些成分的作用至今还不十分清楚，可人们仍然把它们加入培养基中，如碘(I)和钴(Co)等。铁作为一种微量元素，对植物也是必需的，但由于Fe的特殊性质，即很不稳定、易沉淀，需要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常常把Fe盐单独配制，且常以螯合物的形式，把FeS04和它的螯合剂乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)先分别配成溶液，再相互混合使形成螯合铁，以防止沉淀和帮助被植物吸收。也可直接使用现成的NaFe·(EDTA)2。为了使用方便，无论是大量元素还是微量元素都常常是先配制成母液(即比实际培养基中的使用浓度高的贮存液)，贮存在4℃冰箱内或在室温下短期存放。2.3碳源和能源植物组织培养要人工提供碳源作为生长发育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖最常用，效果也最好。然而，在体细胞组织培养中，葡萄糖、麦芽糖、山梨醇糖也有影响；在花药培5养中，麦芽糖也有促进作用。糖类在培养基中除了作为碳源和能源外，还具有维持培养基一定渗透压的作用。2.4维生素类维生素类与植物体内各种酶的形成有关。维生素类的种类很多，在植物组织培养中通常以B族维生素为主，使用浓度一般为0.1～1.0mg·L-1，其中以维生素盐酸硫胺素(Vit.B1)、盐酸吡哆素(Vit.B6)、烟酸(Vit.B3，又称维生素PP)、泛酸钙(Vit.B5)、钴胺素(Vit.B12)、生物素(维生素H)、叶酸（维生素Ｂc）及抗坏血酸（维生素C）最常用。在各种维生素中，Vit.B1可能是必需的，而烟酸及Vit.B6对生长只有促进作用。肌醇(环己六醇)本身不促进外植体生长，但可能有助于活性物质发挥作用，提高Vit.B1的效果，从而促进外植体生长、胚状体及芽的形成；培养基中的肌醇用量为50～100mg·L-1。2.5氨基酸及有机附加物在一些培养基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)等，它们是培养基中重要的有机氮源。最常用的是甘氨酸，它能促进离体根的生长，对植物组织培养物的生长也有良好的促进效果，通常用量为2～3mg·L-1。另外，在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白(LH)、水解酪蛋白(CH)、天然的有机物如椰子汁(椰乳，10％或100～150ml·L-1)、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁（5％～10％）、黄瓜汁（5％～10％）、酵母浸出物（O.5％）、香蕉泥（100～200mg·L-1）等。其作用是提供一些必要的微量营养成分、6生理活性物质和生长激素等，可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用。如培养基中加入100～200mg·L-1的香蕉泥，具较大的pH缓冲作用，主要用于兰花的组织培养，对幼苗发育有促进作用。但由于天然有机物成分复杂且不确定，很难保证重复一致，因而在培养基的配制中更多人仍倾向于选用已知的合成有机物。2.6植物生长调节物质生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽极少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素类最为常用。2.6.1生长素类它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生。生长素类常用的是2,4－D(2，4－二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)，它们作用的强弱顺序为：2,4－DNAAIBAIAA。其使用的适宜浓度：IAA为10-5～10-10mol·L-1，以1～10mg·L-1最常用；2,4－D为10-5～10-10mol·L-1；NAA的适宜浓度范围比前两者都高。2，4－D对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。在大多数情况下，只用2,4－D就可成功地诱导外植体产生愈伤组织，假若将2，4－D等生长素类物质与一种细胞分裂素配合使用时，效果会更好。虽然2,4－D诱导细胞分裂较好，但这个化合物趋向于抑制植物的形态发生，故在诱导再分化时就很少用它(但在禾本科及某些单子叶植物7的培养中，2，4－D却对其器官分化有较好的促进效果)，一般多用NAA或IBA或IAA与一种细胞分裂素配合使用。值得一提的是，低浓度的2,4－D往往有利于胚状体的分化，IBA和NAA广泛用于生根，并能与细胞分裂素互作促进茎芽的增殖。NAA有利于单子叶植物的分化，而IBA诱导生根的效果最好。生长素一般溶于95％酒精或0.1mol／L的NaOH中，以后者的溶解效果更好。2.6.2细胞分裂素类常用的细胞分裂素类有：激动素(简称KT，规范的化学名称是糠基腺嘌呤)、6－苄基腺嘌呤(6－BA)、玉米素(ZT)、2－异戊烯腺嘌呤(2－iP)、吡效隆(4PU，CPPU)和噻重氮苯基脲(TDZ)。它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用。在培养基中加入细胞分裂素的目的，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。由于这类化合物有助于使腋芽由顶端优势的抑制下解放出来，因此也可用于枝条的增殖。就发挥同一生理效应的处理浓度来比较，它们作用的强弱顺序为：TDZ，4PUZT2－iP6－BAKT但在组织培养中通常使用人工合成的、性能稳定又价格适中的KT和6－BA，二者的最适浓度为10-6～lO-7mol·L-1。细胞分裂素一般溶于0.5或1mol／L的HCl或稀薄的NaOH中。此外，赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)和多效唑(PP333)、等生长调节物质也见用于组织培养中。一些植物需要赤霉素和脱落酸增强8生长，而在另一些植物中需要它们抑制生长。GA3是20多种赤霉素中最常用的赤霉素，GA3能促进低密度培养细胞的生长，增加愈伤组织生长，诱导矮化或发育迟缓的植物伸长生长。GA3贮存液最好现用现配，过滤灭菌后加入到培养基中。根据植物种类不同，脱落酸(ABA)在培养基中刺激或抑制愈伤组织生长。据报道，ABA有利于胚胎培养。2.7琼脂琼脂（琼脂粉、琼脂条）是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢，所以在植物组织培养中一直被作为首选固体培养基质而广泛应用。新买来的琼脂应先试其凝固能力后再决定用量。在通常的情况下，纯净度高，含杂质量少，色浅、透明的质量好的琼脂，用量一般在O.6％～1.O％。而色黄、杂质多的琼脂质量较差。当培养基pH值偏酸时，则琼脂用量要增加。此外，加热时间过长、温度过高均会影响其凝固。2.8其他成分2.8.1活性炭活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，例如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰花组织培养中效果更明显。另外，活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害物质，也吸附有利物质，例如植物生长调节物质、培养基成分(Vit.B6、叶酸、烟酸等)。因此使用时应慎重考虑，不宜过浓，一般在O.02％～1.O％，尤以O.1％～O.5％更常用。活性炭对形态发生和器官形成有良好的效9应。在失去胚状体发生能力的胡萝卜悬