第2节核酸的分离纯化

第二节核酸的分离纯化主要内容前言1核酸分离、纯化原则1.1保持核酸分子一级结构的完整性1.2.防止核酸的生物降解2分离提取核酸的主要步骤2.1细胞的破碎2.2核蛋白的解聚、变性蛋白的去除2.3核酸的沉淀2.4核酸的浓度测定2.5核酸的保存核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。前言Home1核酸分离、纯化原则1.1保持核酸分子一级结构的完整性1.1.1意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。1.1.2分离核酸原则：1）温度不要过高；2）控制pH值范围(pH值5-9);3）保持一定离子强度;4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.Home1.2防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。1.2.1DNA酶抑制剂(1）金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；(2）阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。1.2.2RNA酶（RNAase)抑制剂RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。(1)皂土（bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）剧毒。（3)肝素（4）复合硅酸盐（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)Home(1)高速组织捣碎机捣碎(2)玻璃匀浆器匀浆(3)超声波处理法(4)液氮研磨法(5)化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）Home2.1细胞的破碎2.2核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。2.2.1加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；2.2.2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；2.2.3酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。(1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。(2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意Home2.3核酸的沉淀沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。2.3.1核酸沉淀的盐类及浓度盐贮存液浓度（mol/L)终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。2.3.2有机沉淀剂（1）乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。（2）异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。（3）聚乙二醇（PEG）优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。（4）精胺精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。原理是：精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。2.3.3核酸沉淀的温度和时间一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。Home2.4核酸的浓度测定2.4.1紫外分光光度法测DNA和RNA的含量前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml。结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40ug/ml。紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤a．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。b．分光光度计先用一定量的水校正零点。c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。d．计算浓度。双链DNA样品浓度(μg/μl)=OD260×核酸稀释倍数×50/1000；RNA样品浓度(μg/μl)=OD260×核酸稀释倍数×40/1000。e．分析纯度。A：测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。2)小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。测定结果分析B：测RNA纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。2.4.2溴乙锭荧光法测定核酸的含量原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。Home2.5核酸的保存(1)对DNA①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNA①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;②长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。Home