琼脂糖凝胶电泳技术

电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。DNA琼脂糖凝胶电泳的原理DNA分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。EB是强致癌剂。电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套1、胶槽准备①将凝胶托盘放入制胶盒中;②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙;③将制胶盒放在调整好的水平台上。2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。①称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml1×TAE;②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖;③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入DNA染料，并轻轻混匀。3、倒胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的制胶盒内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右冷却，凝胶固化。4、轻轻拔出固定在凝胶中的加样梳。将带凝胶的凝胶托盘置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可,出去样品孔的气泡。6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7μl。8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：5v/cm；时间20-30分钟左右9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。10、电泳结果分析：①紫外检测仪直接观察电源条带②摄影记录有下列因素会影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率：1、市售的琼脂糖的提纯等级。提纯等级越高，电渗及静电相互作用越少，分离效果越好。2、DNA的相对分子质量和空间结构。3、琼脂糖浓度。浓度越高，分离的DNA分子片段越小。4、电场强度。常用的5v/cm的分辨率不高。在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1v/cm。电压过高，电泳分离的线性范围越窄，同时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。5、嵌入染料的存在。EB嵌入到DNA碱基对间，会使线状双链DNA分子迁移率降低15%左右，而对其他构型DNA影响较小。如果对实验结果的精度要求较高，可以在电泳后再染色，而不是把EB直接加入凝胶板中。由于EB为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。6、电泳缓冲液。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液。RNA变性琼脂糖凝胶电泳1、原理：RNA和DNA是2种不同类型的核酸，但它们的结构和组成相似，琼脂糖凝胶电泳检测技术同样可以用于RNA的研究。常用的RNA琼脂糖凝胶电泳有非变性电泳和变性电泳2种。非变性电泳可以分离混合物中不同相对分子质量的RNA分子，但是无法确定相对分子质量。因为RNA是单链分子，局部区域会形成二级结构，在电场中泳动的距离不能反映RNA分子本身的大小。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展成线性，才能根据Marker推算相应谱带RNA的相对分子质量。2、注意事项：①RNA的变性处理如果选择甲醛为变性剂，则需要在通风橱中进行相关操作。如果选用乙二醛-DSMO（二甲亚砜）做变性剂，在电泳时则需要电泳缓冲液的再循环装置，用来避免形成过高H+梯度。②不同的变性剂，电泳缓冲液和加样缓冲液通常也要相应配制。③如果选用乙二醛-DSMO体系作为变性剂，在制胶时，不能直接把染料EB加入凝胶中，乙二醛与EB发生化学反应，会干扰实验进行。要等电泳完毕后把胶浸入EB溶液染色30～40min后紫外灯下观察。④实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须于180℃干烤8h或更长时间（玻璃器皿）或用DEPC水溶液浸泡（塑料制品）。任何一个环节造成了RNAase污染都可能会使电泳结果呈现为无明显谱带或谱带散乱，失去实验价值。核酸分离纯化的原则:保持核酸一级结构的完整性尽可能提高核酸制品的纯度（一）选择原则1.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度2.保持核酸的完整性尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量避免各种有害因素对核酸的破坏（二）技术路线的设计1核酸的释放：化学法、机械法、物理法2分离与纯化：应该清除的杂质主要包括:1.非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖及脂类物质等2.非需要的核酸分子分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质3.加入的有机溶剂和某些金属离子3浓缩、沉淀于洗涤：沉淀是浓缩核酸最常用的方法常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%乙醇洗涤去除原理：加入高浓度醋酸钠（0.3M）后，钠离子可以均匀的分散到DNA的表面，屏蔽掉DNA链上磷酸根上的负电荷，有利于DNA链的压缩。否则，磷酸根相互排斥，DNA不容易聚集。4晾干与溶解：晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）；若长期储存建议使用TE缓冲液溶解