生物分离工程第1章绪论.

2019/12/21生物分离工程舒孝顺教授联系方式:13723895338QQ:6490553762019/12/21教材与参考书目1、《生物分离工程》，田瑞华主编，科学出版社，2008年出版。2、《生物工业下游技术》，毛忠贵主编，中国轻工业出版社，2006年出版。参考教材3、《生物分离原理及技术》，欧阳平凯编，化学工业出版社，1999年出版。2019/12/212019/12/21课程安排讲课32学时课程考核：期末考试占80%，平时成绩占20％。2019/12/21第一章绪论第二章过滤第三章离心与沉降第四章细胞破碎第五章萃取第六章吸附及离子交换第七章色谱分离第八章沉析第九章膜分离和电泳第十章结晶与干燥2019/12/21发酵液预处理细胞分离细胞破碎细胞碎片分离初步纯化胞外产物高度纯化成品加工发酵液的预处理与固液分离原料预处理扩大培养培养基微生物菌株2019/12/21第一章绪论第一节生物分离工程的性质、内容与分类第二节生物分离工程的一般流程第三节生物分离过程的特点第四节生物分离工程的发展历程和动态2019/12/21一、生物分离工程的性质1、生物工程上游：育种、基因工程、细胞工程、酶工程及发酵工程下游：生物产品的回收——生物分离技术第一节生物分离工程的性质、内容与分类上游加工过程：功能物质的发现及优良物种选育（基因工程、细胞工程）生物工程中游加工过程：将原料大规模转化为生物物质（酶工程、发酵工程、动植物细胞培养）下游加工过程：获得产品（生化分离）生物技术各分类间关系生物技术上游与下游加工过程2.生物技术产品2.1生物技术产品定义：发酵、动植物细胞培养、酶反应液和动植物组织细胞与体液中获得的产品2.2内容：常规生物技术产品和现代生物技术产品2.3特点：（1）具有一定的生理活性－结构复杂（2）分布广泛－胞内胞外（3）原始浓度（含量）偏低（4）组分复杂（5）产物稳定性差批间差异大（6）质量要求高（生物医药）（7）价格贵（经济性）3.生物分离工程：为提取生物产品时所需的原理、方法、技术的一门技术科学，指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程(DownstreamProcessing)。单元操作：完成一道工序所需的一种方法和手段。生化分离2019/12/21生物分离工程原理分离的本质在于有效识别混合物中不同溶质间物理、化学和生物学性质的差别。物理性质：力学、热力学、电磁性质；化学性质：化学热力学、化学反应学、光化学；生物学性质：分子识别。分离是混合的逆过程，需要作功才能实现，而且需要有专门过程和设备。如酒精-水2019/12/21二、生物分离工程的研究内容1、生物分离工程主要目标产品类型直接获得产品、间接获得产品（1）按产品的相对分子量大小分：小分子：1000(抗生素、有机酸、氨基酸）大分子：1000(酶、抗体、多肽、蛋白质）（2）按产品所处的位置分：细胞内：胰岛素、干扰素、重组蛋白质细胞外：抗生素、胞外酶2019/12/212、生物分离工程技术原理的探讨3、生物分离工程设备的研究4、生物分离操作过程的设计与优化2019/12/21三、生物分离过程的分类可以按被分离物质的性质分类，也可以按分离过程的本质分类。1、按被分离物质的性质分类：物理分离法、化学分离法、物理化学分离法。2、分离过程的本质分类：平衡分离过程（根据不同组分在两相间分配平衡的差异实现分离）、差速分离过程（利用外加能量强化不同组分迁移的速度差进行分离）、反应分离过程（利用外加能量或化学试剂，促进化学反应进行而达到分离）。2019/12/21例：（1）Absorbance1）非特异性吸附抗生素(吸附)2）特异性吸附抗体3）亲和吸附抗原抗体4）离子交换抗生素（2）Chromatography1）凝胶抗生素、蛋白质(色谱或层析)2）亲和色谱抗体3）离子交换蛋白质（3）ElectricField1）磁性免疫微球抗原抗体(场致分离)2）区带电泳蛋白质3）等速电泳蛋白类4）等点聚焦电泳蛋白类2019/12/21四、生物分离工程的重要性1、生物产品特点（1）粗料发酵：酒精、柠檬酸、酶制剂等；（2）产物浓度低的水溶液（A、氧传递限制；B、细胞量；C、产物抑制）；（3）组分复杂（大分子、小分子、可溶物、不可溶物、化学添加物）；（4）产物稳定性差（化学降解、微生物降解）；（5）质量要求高（食品或药品）；（6）分批操作，生物变异性大。2019/12/212、生物分离工程的重要性（1）生化产品的必经的过程。（2）回收率不高。抗生素(80%左右)，蛋白质(60-90%)。（3）分离纯化昂贵。分离纯化成本占总成本40-80%；药用产品的成本更高；大多数酶70%。（4）基因工程的R&D费用，分离纯化占50-80%。（5）中药现代化的重要技术平台。生化分析、药学等。（6）提高产品竞争力的关键技术之一。（7）环境污染的治理。1.体系特殊：（1）试验方法设计困难－原料液成分复杂（2）操作条件要求温和－目的物稳定性差（3）收率低－原料中目的物浓度低、产品纯度要求高2.工艺流程（1）操作工艺弹性大－生物变异性大（2）操作条件（环境）严格、无菌或密封3.成本高五.生物分离工程的特点1.分离的工艺过程原料预处理初步分离细胞内成品高度纯化细胞外沉淀吸附萃取超滤层析离子交换亲和吸附电泳无菌过滤超滤冷冻干燥喷雾干燥结晶第二节生物分离工程的一般过程分离装置分离剂（能量或者物质）分离纯化过程的一般原则原料产品2019/12/212、产品的分离提取工艺与下列情况有关（1）是胞内产物还是胞外产物；（2）原料中产物和主要杂质的浓度；（3）产物和主要杂质的产物和主要杂质的物理化学特性及差异；（4）产品主要用途和标准；（5）产品的市场价格；（6）废液的处理方法等。2019/12/213、生物分离工艺流程①发酵液的预处理；②提取（初步分离）；③精制（高度纯化）；④成品制备。主要分离工艺过程原料预处理初步分离细胞内成品高度纯化细胞外沉淀吸附萃取超滤层析离子交换亲和吸附电泳无菌过滤超滤冷冻干燥喷雾干燥结晶3.1原料的选择（原则）（1）材料新鲜，目的物含量高如：胰岛素、胸腺素、凝乳酶、微生物中的核酸、酶等（2）材料易得，来源丰富（3）稳定性好（4）工艺简单、有综合利用价值2019/12/213.2预处理及固液分离（1）预处理a.动物：去皮、去脂肪，冷冻、干燥b.植物：干燥c.微生物：菌体和菌液（发酵液）加热、稀释、pH、凝聚与絮凝、加助滤剂或反应剂（2）固－液分离：过滤、沉降、离心（3）细胞破碎a.机械法：匀浆法、球磨法b.非机械法：E法、化学法、物理法2019/12/21（4）发酵液的预处理与固液分离主要技术有过滤和离心。固液分离是除去发酵液中的不溶性固形物杂质和菌体细胞。首选过滤，运转费用低。如是胞内产物，需进行细胞破碎。2019/12/213.3提取（初步分离）目的是除去与产物性质差异较大的杂质，便于精制工序生产。要求目的产物有较大的浓缩比过程。可选的单元操作范围较广，如吸附、萃取、沉淀、超滤等单元操作。1.吸附法a.原理：范德华力或H键b.常用吸附剂：硅胶、活性炭、大孔树脂等c.应用：抗生素等分离、脱色2.离子交换法a.原理：静电引力b.常用：阴、阳离子交换剂c.应用：带电物质如：aa、蛋白质、多糖、无机离子等4.沉淀法：盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、非离子型聚合物、聚电解质等5.萃取a.定义：利用溶质在两个互不相溶的两相间溶解度不同而进行分离的方法。b.种类：溶剂萃取、双水相萃取、反胶团萃取、超临界流体萃取6.膜分离微滤、超滤、纳滤，透析、反渗透、电渗析等2019/12/213.4精制（高度纯化）目的是除去与产物的物理化学性质比较接近的杂质。通常采用对产物有高度选择性的技术。•层析技术（色谱技术）（1）流动相状态：GC与HPLC、TLC（2）固定相：柱色谱与薄层色谱（3）原理：离子交换色谱、吸附色谱、凝胶色谱、亲和色谱3.5成品加工（1）浓缩：蒸发、超滤、反渗透等（2）结晶（3）干燥：喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥等（4）无菌过滤：2019/12/214、产品收率产品的收得率和质量控制是分离工程的主线。（1）φn-总回收率；λn-各单元回收率分离步骤越多，回收率越低。如φ10=(0.95)10=0.63；φ5=(0.95)5=0.77（2）分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长。2019/12/212019/12/212019/12/212019/12/21二、生物分离过程的选择准则（1）步骤少；（2）次序合理（例如盐析、离子交换）；（3）产品规格（注射、非注射）；（4）生产规模；（5）物料组成；（6）产品形式（固体适当结晶，液体适当浓缩）；（7）产品稳定性；（8）物理性质：溶解度、分子电荷、分子大小、功能团、挥发性等；（9）危害性；（10）废水处理。2019/12/21具体：（1）尽可能简单、低耗、高效、快速；（2）分离步骤尽可能少；（3）避免相同原理的分离技术多次重复出现；比如，分子筛和超滤技术按分子量大小分离，重复应用两次以上，意义就不大了。2019/12/21（4）尽量减少新化合物进入待分离的溶液；A)引起新的化学污染；B)蛋白质的变性失活（5）合理的分离步骤次序；原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。2019/12/21（6）掌握产物的理化性质，主要包括：(A)溶解度及影响因素（温度、pH值、有机溶剂和盐等）；(B)分子量和分子形状（高分子物质）；(C)沸点和蒸汽压（热稳定的小分子物质）；(D)极性大小；(E)分子电荷及影响因素（pH和盐等）；2019/12/21(F)功能团（功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据）；(G)免疫原性（设计亲和色谱）；(I)稳定性及其影响因素（温度、pH值、毒性试剂等)；如青霉素低pH的不稳定性(J)等电点pI。2019/12/21（7）成品规格（或产品质量标准）五肽胃泌素的上海市药品标准指标名称指标含量（C37H49N7O9S）97.0比旋光度-25˚~-29˚吸收值比A(280nm):A(288nm)=1.12-1.22氨基酸各氨基酸之比为1干燥失重，%0.52019/12/21（8）物料的组成和性质(A)目的产物的浓度。高？低？(B)与目的产物相近物质的物理化学性质。(C)目的产物的定位。是胞内还是胞外？(D)菌种的种类和形态。(E)微生物的含量和发酵液的黏度。（9）生产规模（10）分批分离还是连续纯化2019/12/21（11）危害性(A)离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。(B)目的产物本身的危害性：抗肿瘤代谢类药物、类固醇类、抗生素、激素类药物等。(C)试剂危害：萃取试剂CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。(D)微生物的危害：重组DNA工程菌不能任意排放。这一菌种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。2019/12/21（12）对环境影响的考虑1）废水A、除菌过滤和灭菌处理；B、符合BOD的要求；2）废料A、灭菌处理；B、综合利用：动物饲料、饲料添加剂，有机肥料2019/12/213）废气A、除菌过滤和灭菌处理；B、废气（有机溶剂）回收4）溶剂的回收A、减少环境排放，减少污染；B、循环利用，减低成本2019/12/21附：抗菌素的分离过程中浓度与纯度的变化步骤过程产品浓度（g/L）纯度（%）发酵液发酵0.1-50.1-1固形物分离过滤1.0-50.2-2分离萃取5-501-10纯化色谱50-20050-80产品精制结晶20-20090-1002019/12/21三、工业常用的生物分离技术（1）回收技术：絮凝、离心、过滤、微过滤等。（2）细胞破碎技术：球磨、高压匀浆、化学破碎等。（3）初步纯化技术：吸附、离子交换、沉淀（盐析、有机溶剂沉淀、等电点、沉淀剂）、萃取、膜分离技术、超滤等。（4）高度纯化技术：离子交换、结晶、各类色谱（层析）技术，如亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱等。（5）成品加工：浓缩、喷雾干燥、气流干