生物化学大实验

生物化学大实验第一部分蛋白质提取、纯化及分析技术实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、原理与目的多酚氧化酶（有3类，儿茶酚酶、戚酶、甲苯酚酶），它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化和种皮透性的调节，属于末端氧化酶的一种。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。多酚氧化酶的活性与植物抗病有一定联系，植物免疫机理现在认为主要是产生对病源有害物质。已发现具有免疫作用的有害物质是多种多样的，概括为两种类型，其中的一种类型就是原有的有毒物质，植物本身含有的一些对病菌有抑制作用，使病菌无法在寄主中生长。很早就发现酚类化合物与抗病有明显的相关，例如原儿茶酸与儿茶酚对有色洋葱磷茎炭疽病菌的抑制作用。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用：氧化底物NADH＋H+醌H2O底物NAD+酚1/2O2但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。因此，许多学者对此进行研究，并从一些植物组织中分离纯化这种酶，研究酶的理化性质和生化特性。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。二、材料与试剂（1）马铃薯（大约每小组150-200g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，0.005mMgCL2）配置时配。（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH计和PH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机三、操作步骤1．粗酶提取：马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。2．盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。沉淀用0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MMgCL2）溶解，装入透析袋中用0.02NKCL溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。四、实验结果获得PPO粗酶液供上柱使用。实验二胰酶分离提取一、原理与目的胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶制剂，胰酶的分离提取时普通生物化学实验的最主要、最经典的实验。胰蛋白酶结晶最初以牛的胰脏为材料而制备，现用羊、猪、马、鼠等哺乳动物的胰脏亦可制备结晶。所不同的是，在提取制备的过程中所需的pH值、PI和结晶的构型上有区别。提取制备酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，最后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。胰酶在PH3.0时最稳定，可在低温下储存较长的时间而不失活；低与此PH酶易变性；高于PH5时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程应在低温和低PH下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原在正常生理条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我环化成为有活性的酶。猪胰蛋白酶原分子量约24000－25000，而猪胰酶分子量为23400。在酶原活化的过程中，酶原N端Lys与Ile之间的一个肽链被断裂，丢失一个6肽，分子构象发生改变，PI变成10.8。本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。二、材料与试剂1．仪器紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、PH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盆、乳钵、大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、PH试纸，滤纸、玻璃器皿等。2．材料：新鲜猪胰脏3．试剂及溶液配制pH2.5乙酸酸化水、2.5MH2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5MNaOH溶液、01MHCL溶液、0.025MHCL溶液、0.01MHCL溶液、0.4MpH9.0硼酸缓冲液（母液为0.8M，用时稀释一倍）、Tris、硫酸铵。0.8MpH9.0硼酸缓冲液：取20ml0.8M四硼酸钠溶液，混合后用PH计校正。三、操作步骤（1）新鲜猪胰脏一个，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，低温下用绞肉机绞碎，加入1-2倍体积预冷的pH2.5-3.0乙酸酸化水溶液（100ml）提取。用10%乙酸调节pH在3.0以下，冷室5℃提取20h。胰蛋白酶提取关键：控制低温；控制pH低于3.0，维持胰蛋白酶提取过程中的稳定。操作过程中的问题：乙酸调节酸度不稳定。（2）过夜后粗提取物四层纱布过滤，滤液呈乳白色，滤渣再加入50ml乙酸溶液浸提残渣，浸提2h。合并滤液。（3）浸提液离心，取上层黄绿色清液，加固体粉状硫酸铵，至40％饱和度，盐析1hr。（4）冷置后离心12000rpm离心10min，得胰蛋白酶粗制品。（5）上清液加硫酸铵，至75％饱和度盐析1hr；12000rpm离心10min；沉淀溶于10mlpH7.5,0.1MTris透析过夜，4℃保存。四、实验结果获得胰酶粗提液。实验三卵清蛋白分离提取一、原理与目的鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1.鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量为28000，但糖成份上有差别。有四种不同的组份，PI的范围为3.9-4.5,280nm的消光系数为A=4.13（1%，1cm）。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白作为亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱。二、材料与试剂：1．材料：新鲜鸡蛋2只2：仪器：抽滤瓶500－1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器3：试剂：10％TCA，用固体NaOH调调PH至1.05－1.10，需要50ml、5NHCL、5NNaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml；pH8.0,0.1MTris-HCL缓冲液三、操作步骤（1）新鲜鸡蛋两枚取蛋清50ml于烧杯中。25℃外用热水浴中缓慢加入50ml三氯乙酸-丙酮（V/V1:2）,再继续搅拌30min。4℃静置过夜操作关键：要在热水浴中缓慢加入有机溶剂，不可在热水浴之前加入；取蛋清时注意不能混入蛋黄，否则引入杂蛋白。（2）粗提取物于50ml离心管10000g离心10min，取上清液50ml，加入4℃预冷的丙酮200ml，4℃放置2h。（3）放置后取沉淀离心10000rpm离心5min，收集沉淀加沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h，换水两次。收集沉淀，再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜。（4）透析液离心4000g10min，取上层清液，加蒸馏水至35ml，用于亲和柱层析。四、实验结果得到卵清蛋白纯化物。实验四离子交换层析和凝胶色谱层析纯化PPO一、原理与目的柱层析技术是最常用的蛋白质纯化手段，在普通生化操作中通过离子交换层析和凝胶层析连用实现蛋白质的纯化。离子交换剂是一种不溶性高分子化合物，分子中含有解离基团，在水中能与溶液中其他离子起交换作用。当一定量的溶液通过交换柱时，溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，全部被吸附到树脂上。交换反应都是平衡反应，在连续添加新的交换溶液下，平衡不断按正方向进行，直至把离子交换剂上的原离子全部洗脱下来。以上两种成分被交换着吸附在离子交换剂上，用洗脱剂洗脱时，被洗脱的能力则决定于各自洗脱反应的平衡常数。本实验中用凝胶色谱技术分离纯化PPO。其原理是通过分子筛效应，将样品中某一固定大小的蛋白质分子分离出来。二、材料与试剂试剂：0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；葡聚糖凝胶SephadexG-200等；实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机三、操作步骤1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡（1）柱材处理称取一定量的SephadexG-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。（2）装柱将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，保持液面比胶面高1-2cm，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。3）平衡在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001MEDTA)，平衡SephadexG-200凝胶。2．上样：将粗酶液上柱。3．洗脱：用0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001MEDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。4．测定酶活性和蛋白质浓度四、实验结果加考马司亮兰检测蛋白，取含有蛋白的洗脱液，以供后续实验检测蛋白含量和酶活用。实验五酶含量及活性测定一、原理与目的蛋白质含量测定是生物化学实验中一个重要的实验技术。测定方法主要有：1，根据蛋白质中N含量基本恒定（16%）为基础的凯氏定氮法；2，根据组成蛋白质的Phe、Trp、Tyr3个带苯环氨基酸在280nm具有吸收的特性为基础的紫外吸收法；3，利用蛋白质的一些特殊理化反应，使蛋白质与一些专一性化学试剂反应产生颜色，其颜色深浅与蛋白质浓度相关为基础的双缩脲法和Lawry法、考马斯亮蓝G-250法等。双缩脲法：蛋白质含有两个以上的肽键，因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2＋形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸成份无关。在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540～560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线，求出未知样品的蛋白质浓度。考马斯亮蓝G-250测量蛋白质含量原理：考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，其最大吸收波长由465nm转变为595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，595nm处的光密度值与蛋白质浓度成反比，可用比色法进行蛋白质定量测定。二