生物化学实验报告蛋白质分子量的测定凝胶层析法

实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好是有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求得；Vi可由g×Wr求得（g为干胶重量，单位为克；Wr为凝胶的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积Vo，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为Vo时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为Vo+Vi时，出现洗脱峰。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logM,式中M为相对分子质量，K1和K2为常数,Ve也可用Ve-Vo。葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的物质。例如SephardexG-75的分级范围是3000-80000的球形分子。在本实验中用于分离蓝色葡聚糖和牛血清蛋白、胃蛋白酶、CytC。三、仪器和试剂1.仪器:层析柱核酸蛋白检测器（或紫外分光光度计）、自动部分收集器、刻度管。2.试剂:蓝色葡聚糖2000、SephardexG-75、洗脱液：0.2mol/LTris-HCL-KCL,PH7.5。3.待测样品:蓝色葡聚糖、牛血清蛋白、胃蛋白酶、CytC。四、实验步骤1．凝胶溶胀凝胶颗粒要求大小比较均匀，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖SephardexG-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不同而不同），或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。2．装柱与平衡装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析柱垂直装好。关闭出口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。3.调整洗脱速度上样前应调整洗脱速度，用自动收集器收集流出液，记录每收集2ml液体所需时间，调整其速度在2min左右。按上述时间设置自动更换收集管。3．上样与洗脱样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面1～2mm时，关闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面，应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算流出体积，当样品滲入床中接近床表面1mm时关闭出口。按加样操作，用少量（约1ml）洗脱液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上，使高出床表面3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床容积的1—2%；制备用量为柱床容积的20%~30%。4．收集与鉴定每个收集管内液体用紫外检测仪在280nm波长处检测，出现最高的一个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积Ve。5．凝胶柱的处理凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗涤。短期可保存在水相中，加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥状态保存。五、实验结果蓝色葡聚糖-2000Ve（ml）OD值牛血清白蛋白Ve（ml）OD值0000.01420.01820.02840.02540.04460.03760.05380.08580.09100.135100.113120.203120.258140.238140.387160.265160.778180.318180.995200.238201.003220.165220.762240.15240.262260.089260.12280.034280.054300.027胃蛋白酶Ve（ml）OD值CytCVe（ml）OD值00.01700.01320.01920.01540.05140.03160.07760.04980.08580.057100.098100.141120.15120.167140.184140.211160.253160.263180.296180.385200.313200.489220.18220.592240.092240.263260.078260.211280.063280.113300.036300.077320.02做出洗脱曲线：蓝色葡聚糖-2000牛血清蛋白胃蛋白酶CytC绘出标准曲线如下：六、注意事项1.在装柱过程中是需要注意的有以下要求：垂直放置，防止产生气泡，防止柱分层。柱上表面要平，平衡柱时间要长一些，让凝胶充分沉积为均一的柱床。2.加样前打开出口，使展开剂流出，至正好露出凝胶上平面时，立即关闭出口3.加样时，用滴管缓缓沿柱内壁旋转加入柱子。七、讨论：1.从洗脱曲线上可以看出，出现了四个较明显的峰值（实验结果较为理想）：OD:0.318(Ve=18ml)，1.003（Ve=20ml），0.313（Ve=20ml），0.592（Ve=22ml），分别对照试验中所加样的四种蛋白质。由于分子量大的先洗脱出来，小分子量的蛋白后洗脱出来，因此洗脱顺序是蓝色葡聚糖-2000（200KD），牛血清白蛋白（67KD），胃蛋白酶（36KD），Cytc（13.7KD）。可能由于洗脱体积间差距较小，且每管体积为整数，导致牛血清蛋白和胃蛋白酶之间洗脱体积差距未能体现出来。2.实验过程中，可能由于加样时将凝胶柱的上表面破坏了，导致部分数据不准确，与预期的效果有点误差。