生物发光共振能量转移

BRET生物发光共振能量转移技术简介：生物发光共振能量转移（BRET）技术是近10年来出现的一种新的检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术.它的最大优势是能在活细胞中实时进行检测，因此能够进行相互作用动力学的研究。在应用这个系统研究感兴趣的蛋白前，首先需要将Rluc或者EYFP融合到每个蛋白或者他们的辅蛋白上。在细胞中，融合蛋白共表达，然后和荧光素酶和其底物腔肠素反应，当能量供体Rluc，能量受体EYFP之间距离比较近的时候(10-100Å)，那么光将从Rluc(峰值480nm发射)传递到EYFP，形成它的激发，并且发射一个波长在530nm的发射光，BRET量化的程度以发射光530nm和480nm的比率表示。实验流程1、用于BRET的表达质粒构建；2、融合蛋白表达检测；3、BRET实验；4、实验结果分析及提交实验报告客户提供1、目的基因cDNA（也可由我公司提供基因克隆）2、用于实验细胞（如果我公司细胞库有可不需提供）公司提供详细实验步骤、使用仪器、及结果分析等详细实验报告。服务周期和价格具体咨询本公司荧光共振能量转移（FRET）荧光共振能量转移-FRET（FluorescentResonanceEnergyTransfer）指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。（1）FRET发生条件：能量匹配：供体分子的发射光谱可以被受体分子吸收并产生荧光信号。供体分子的发射光谱应与受体分子的激发光谱必须有显著重叠（30%）；作用距离：供体分子与受体分子的作用距离为1-10nm；FRET效率公式：用于计算分子/基团间作用距离R偶极-偶极作用：供体分子与受体分子作用时的向量必须满足一定条件。（2）FRET的应用：通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息（作用距离、作用方向、能量传递效率）。常用于解决如下问题：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合体；转录机制；转化途径；分子运动；蛋白折叠等生物学问题。（3）FRET常见的供体-受体荧光分子对：荧光蛋白类：染料类：FRET检测HIV附属蛋白与细胞膜CD分子相互作用摘自：AFlowCytometry-BasedFRETAssaytoIdentifyandAnalyseProtein-ProteinInteractionsinLivingCellsCarinaBanning,Jo¨rgVotteler,etal.图释：流式细胞仪FACSAria检测FRET信号。（a）活的293T细胞分别单独转入CFP、YFP、CFP/YFP、CFP/YFP融合蛋白作为对照，确定最好的圈门方式为CFP/FRET。（b）293T细胞经过2%PFA处理后，YFP荧光强度出现明显下降。筛选有相互作用的未知蛋白质的流程图释：流式细胞仪FACSAria进行FACS-FRET高通量筛选感兴趣蛋白相互作用的未知蛋白。（a）FACS-FRET筛选流程。（b）在活的293T细胞中转入Vpu-YFP作为诱饵，与等量的CFP融合蛋白（蛋白的cDNA库）相互作用36小时后，分选FERT+细胞。FRET研究蛋白酶功能摘自：DetectionofInfectivePoliovirusbyaSimple,Rapid,andSensitiveFlowCytometryMethodBasedonFluorescenceResonanceEnergyTransferTechnologyJasonL.Canteraetal.Appliedandenvironmentalmicrobiology,Jan.2010,p.584-588图释：流式细胞仪FACSAria检测脊髓灰质炎病毒（PV1）10倍感染BGM-PV细胞，8小时后上机检测。A~C病毒浓度分别为0.4~0.004，D为阴性对照。双分子荧光互补技术BiFC（BimolecularFluorescenceComplementation）是将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两段，分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。活细胞收集后，在流式细胞仪中的检测是实时进行的，只要细胞中有荧光产生就会被捕捉到信号，因此，不论是亲和力较弱的结合还是暂时性的结合都不会被遗漏。双分子荧光互补技术原理示意图(a)诱饵和捕获蛋白分别携带CYFP和NYFP两段YFP荧光蛋白片段(b)诱饵和捕获蛋白结合同时CYFP与NYFP形成YFP(c)形成的YFP发出荧光（1）BiFC检测的特点：活细胞分析；可以用于研究2种或2种以上的启动子调控之下的蛋白质相互作用；具有很高的信噪比，弱蛋白相互作用也可以检测到（7nm）。（2）可用于BiFC的荧光蛋白：GFP、BFP、CFP、YFP，生理条件可用的黄色的Venus和citrine，青色的cerulean；红色系统：mRFP2Q66T、mCherry；Venus（EYFP的变体）是目前用于BiFC分析最多的荧光蛋白，因为其荧光强且背景敏感度降低，是BiFC分析理想的荧光蛋白。常见的用于双分子荧光互补技术的荧光蛋白BiFC研究复合体中亚基间的相互作用摘自：DetectionandCharacterizationofInfluenzaAVirusPA-PB2InteractionthroughaBimolecularFluorescenceComplementationAssayJosephN.Hemerka,DanWang,etal.JOURNALOFVIROLOGY,Apr.2009,p.3944-3955图释：流式细胞仪FACSCalibur检测流感病毒复合体中亚基PA-PB2间的相互作用。（B）流式检测同时转入PA/PB2的COS-1细胞及单转入PA-VC的细胞的Venus荧光信号，显示转入24小时后的荧光强度。（C）萤火虫荧光蛋白酶显示，转入单或双质粒的细胞，萤火虫荧光蛋白酶活性一致。BiFC研究信号传导通路中蛋白质间的相互作用摘自：Characterizationofthelatentmembraneprotein1signalingcomplexofEpstein-BarrvirusinthemembraneofmammaliancellswithbimolecularfluorescencecomplementationPoojaTalaty,AmandaEmery,etal.VirologyJournal2011,8:414图释：流式细胞仪FACSLSRII检测BiFC信号。LMP1-NYFP和LMP1-NYFP突变体分别与CYFP-TRAF2、CYFP-TRAF3转入细胞内，检测其相互作用。曲线蓝色部分为出现YFP的荧光阳性表达，表明LMP1与CYFP、CYFP均存在相互作用。科普一下SCI《科学引文索引》（ScienceCitationIndex,简称SCI）于1957年由美国科学信息研究所（InstituteforScientificInformation,简称ISI）在美国费城创办，是由美国科学信息研究所(ISI)1961年创办出版的引文数据库。SCI(科学引文索引)、EI(工程索引)、ISTP(科技会议录索引)是世界著名的三大科技文献检索系统，是国际公认的进行科学统计与科学评价的主要检索工具。1976年，ISI在SCI基础上引出期刊引用报告（journalcitationreport,JCR），提供了一套统计数据，展示科学期刊被引用情况、发表论文数量以及论文的平均被引用情况。在JCR中可以计算出每种期刊的影响因子（ImpactFactor,IF）。影响因子的高低，在一定程度上可以反应一个期刊的影响力。（百度百科）期刊的影响因子(Impactfactor；IF)计算方式：IF2014=(该杂志2012-2013年发表文章在2014年被引用的次数/(该杂志2012-2013年发表文章的总数)附件是最近两年的SCI期刊列表，2014年植物学类我红色标注了部分，不过期刊名都是缩写，2013年的是全称期刊名。影响因子从高到低排列，大体代表了期刊的水平档次。三大国际顶尖期刊CNS，指CELL，NATURE，SCIENCE。国际植物学专业期刊中，最好的研究论文期刊是PlantCell（IF2004=9.338），当然今年新创刊的NATUREPLANTS估计不久的将来会后来居上。最好的3本综述类期刊是AnnualReviewofPlantBiology，TRENDSINPLANTSCIENCE和CURRENTOPINIONINPLANTBIOLOGY。中国主办的期刊中，生物类最高的是CELLRESEARCH（CELLRES，IF2004=12.413），植物类最高的是MolecularPlant（MOLPLANT，IF2014=6.337）。