生物无机化学作业-金属β内酰胺酶

金属β内酰胺酶概述——具有催化活性的含锌位点摘要：锌在生物系统中扮演着非常重要的角色，人体内大约有10%的的蛋白质可能与锌结合，锌指蛋白是生物体内含锌金属蛋白（Zincmetalloproteins）中丰度最高的一种。含锌蛋白质的表达增加或减少或者表达错误与多种重大疾病相关，如癌症，糖尿病等[1]。因此，含锌金属蛋白逐渐引起人们越来越多的关注。本文着重讲述其中一种含锌金属蛋白——金属β内酰胺酶(Metallo-β-lactamases，mβLs)。关键词：金属β内酰胺酶分类结构作用机理Zn2+抑制剂含锌金属蛋白锌位点根据其作用不同可以大致分为两类：起催化活性的与只起结构结构作用的。具有催化活性的含锌位点一般在中心离子锌离子有一个可以迅速改变的水分子作为配体，以发挥其催化活性，而只起结构作用的锌位点则没有水分子作为配体，其配体全部都是蛋白质的氨基酸残基[1]。本文着重介绍前者，具有锌位点催化活性的含锌金属蛋白。锌位点具有催化活性的含锌金属蛋白，根据文献分类，可大致分为五种：基质金属蛋白（Matrixmetalloproteinases,MMPs），组蛋白脱乙酰基（Histonedeacetylases,HDACs）,蛋白异戊二烯基转移酶（Proteinprenyltransferases，PTs），金属β内酰胺酶(Metallo-β-lactamases，mβLs)，铜锌氢氧化物歧化酶（Cu,Zn-superoxidedismutase，SOD-1）[1]。这几类酶在生物体中都介导着非常重要的生化反应，同时也与多种重要疾病关系密切，如表1所述。表1锌位点具有催化活性的含锌金属蛋白酶与疾病的关系[1]酶介导的疾病MMPs癌症、糖尿病、中枢退行性病变、关节炎、感染性疾病HDACs癌症、中枢退行性疾病、炎症相关疾病、糖尿病PTs癌症、风湿性关节炎、寄生虫感染、多发性硬化SOD-1家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化症mβLs细菌对抗生素的耐药性本文着重讲述金属β内酰胺酶。（一）β内酰胺酶β内酰胺类抗生素是最古老的，最廉价，使用最广泛的抗生素家族，其中包括青霉素类，头孢菌素类，青霉烯类，碳青霉烯类，单环β内酰胺类等[1,2]。β内酰胺酶是细菌对此类抗生素产生耐药性的最主要的原因。这类酶可以催化使β内酰胺环上酰胺键断裂从而使抗生素失活。一般的，将β内酰胺酶分为四类，分别是A、B、C和D类，其中A，C和D类丝氨酸-β-内酰胺酶，借助活性丝氨酸催化抗生素水解，B类则是金属β内酰胺酶，一般活性中心有1-2个锌离子参与抗生素的水解。丝氨酸-β-内酰胺酶不能水解碳青霉烯类抗生素，而金属β内酰胺酶则能水解除单环β内酰胺酶之外的所有的抗生素（包括碳青霉烯类），同时，由于编码金属β内酰胺酶的基因有一部分来源于质粒，可以在细菌之间转染，从而使本来不能产生该酶的菌株也能产生耐药性，并且目前为止，没有一种抗金属β内酰胺酶的药物上市，因此给临床抗生素的应用带来极大的障碍[2]。（二）金属β内酰胺酶2.1分类根据氨基酸序列同源性以及酶的性质，金属β内酰胺酶一般分为三类，分别是B1，B2和B3[3]。B1亚类的酶氨基酸序列上有23%以上的相似性，B2亚类只有11%的相似性，B3亚类则只有9个保守的氨基酸残基相同。金属β内酰胺酶的来源见表2表2：金属β内酰胺酶的来源[2]2.2结构尽管氨基酸序列不尽相同，但是几种金属β内酰胺酶的空间构象却有很大的相似性，都拥有αββα这样的折叠形式，且催化活性中心存在于两个β折叠的夹层之间[2]。三种亚类的晶体结构见图1。B1、B2和B3中心都有2个金属Zn2+，分别是Zn1和Zn2，这两个金属锌离子由周围的氨基酸残基与水分子共同完成配位。对于配位的氨基酸残基情况见表2及图2。表2三个亚类中Zn1和Zn2的配位情况亚类Zn1Zn2B1His116、His118、His196Asp120、Cys221、His263B2Asn116、His118、His196Asp120、Cys221、His263B3His116、His118、His196Asp120、His221、His263另外，Zn1与Zn2之间通过羟基完成配位，且Zn2还有一个水分子与之配位[1]。具体见图4。2.3催化机理三种金属β内酰胺酶催化β内酰胺类反应的机理并不完全相同。大体的讲，B1和B3是双锌酶催化，Zn1其主要催化作用，Zn2的存在可以使Zn1的活性提高，而B2则是单锌酶催化，Zn2起主要的催化作用，Zn1的存在则会使催化活性降低[1]。图1：B1、B2和B3金属β内酰胺酶的晶体结构。（a）B1；（c）B2；（d）B3[2]。图2:三个金属β内酰胺酶亚类锌离子的配位情况，从左到右依次是B1、B2、B3[2]。图3：单锌酶催化机理图[4]图4：双锌酶催化机理图[1]1998年，Bounaga等通过研究来自B1亚类的BcII酶，提出了单锌酶催化的机理，简单来讲就是Zn1与3个组氨酸及1个水分子配位，锌离子作为一个路易斯酸，使水分子的pKa降低，因此在中性条件下，水分子解离，形成氢氧根离子，该氢氧根离子作为亲核试剂进攻β内酰胺的羰基碳，形成一个含锌离子的四元环中间过渡态，120位的天冬氨酸由于水分子去质子化作用获得一个质子而具有酸性，因此进攻酰胺键的氨基，从而使酰胺键断裂，进而完成对β内酰胺类的水解。但是对于该酶，双锌酶催化的效率是单锌酶催化的2倍[2]。机理图见图3。该机理是利用研究较多，结构较为清晰的B1亚类为模型，且采用了单锌催化这种较为简单的催化机制进行研究，阐述的催化机制较为简单也比较清晰易懂，为之后该酶的催化机制的深入研究开创了先河，但B1本来是一种双锌催化的蛋白酶，这种单锌机制脱离了该酶催化的真实状态。双锌酶催化的机理，简单来讲，就是Zn1与Zn2之间本来就有一个羟基来连接彼此。在催化水解之前，Zn2先结合一个水分子。当底物到达活性口袋以后，连接两者的羟基与Zn2分离，去进攻底物的羰基碳，同时Zn1与羰基氧结合，稳定中间过渡态，金属β内酰胺酶上224位的酪氨酸则与羧基上的羟基集合，Zn2与羧基上的羰基结合，使底物构象稳定。当与Zn2结合的水分子的质子给底物氨基以后，底物的酰胺键断裂，这时，与Zn2结合的羟基与Zn1络合，再次回归催化反应之前的状态[1,2,4]。具体反应过程图见图4。这种对B1亚类双锌催化的研究更接近该酶催化的真实状态，可信度高，但目前仅仅停留在B1亚类方面，对于同是双锌催化的B3亚类的研究还需继续跟进。而对于B2亚类，只有单锌催化时，活性最高，过去认为，该酶上120位的天冬氨酸残基作为路易斯碱使水分子活化，提供羟基作为亲核试剂进攻，但是2011年，Fatima等研究发现，B2类MBLs在催化水解反应中水分子是通过His118激活的，而不是原先所认为Asp120或锌离子，他们对B2类的催化提出了新的机理。他们认为，底物到达活性口袋以后，Zn2首先与侧链羧基上的羰基氧结合，224位的酪氨酸与羧基上的羟基结合，稳定底物构象，同时，被118位的组氨酸活化的水分子作为亲核试剂进攻β内酰胺环上的羰基碳，导致开环。此时，酰胺键上的氮原子也与Zn2完成配位，形成一个五元环过渡态，氮上的电子发生离域以稳定过渡态。接下来，完成氮原子上加氢这一步。作者认为，这一步实际上是加在β内酰胺3位上的C上，然后通过异构完成水解产物的生成。具体机理图见图5[5]。该假说针对B2亚类的特殊性研究了其催化机制，证实了与之前的双锌催化的不同之处，接近真实状态，可信度高，但目前，氮上质子的给予只停留在猜想阶段，并没有检测到异构体与中间体，因此还需进一步进行探索。另外，在读文献的过程中，有些研究曾用外层电子构型相似的Cu+,Ni+替代Zn2+，有的研究发现酶的催化活性升高，但有的研究发现，酶的催化活性会降低，说明该酶的催化机制可能还有更复杂的机理需要图5：B2亚类单锌水解的机理图探讨，而且对于实验设计的合理性也提出了挑战[6]。2．4Zn2+的作用在金属β内酰胺酶水解的机理研究中，锌离子作为中心离子，都发挥了很重要的作用，总结以上所述，可知Zn2+主要作用有两点：（1）、作为Lewis酸，使水分子pKa降低，活化水分子，产生亲核试剂；（2）与羰基配位，是亲核进攻反应容易进行（Zn1）或者使底物分子构象稳定（Zn2）。因此，锌离子一方面使反应能够发生，另一方面使反应容易进行，可以理解为从热力学与动力学两方面发挥作用。锌离子之所以能发挥这样的作用，从根本上讲，是因为锌离子本身的化学性质。锌离子的外层电子构型是4d10，内层轨道全部充满，配位性质不受配体晶体场的影响，因此配位稳定，由于没有变价，因此不受氧化还原的影响，同时，原子半径合适，是中等程度的Lewis酸，可以与O、N、S等配位，适合生物体中作为蛋白质中心金属离子[1]。这些性质都使得含锌离子的金属β内酰胺酶十分稳定，因此有很强的抗β内酰胺的作用，所以给我们抗生素的使用带来很大的障碍。2.5金属β内酰胺酶抑制剂至于对酶催化机制有了充分的了解，才能选择合适的靶标来研发药物。笔者认为，根据现阶段认识到的含锌金属蛋白的催化机制，可以采用锌离子的螯合剂，屏蔽锌离子的催化功能，钝化催化活性有关的氨基酸残基，底物类似物来竞争性拮抗酶的活性，通过位阻作用来抑制水分子的亲核进攻等多方面来对该类酶进行抑制，从而提高临床上β内酰胺类抗生素的疗效。我们现在对新药的开发应该是基于基础研究对机制的了解，针对明确的靶点来设计和评价药物，而不是通过随机合成的大量药物的随机筛选来开发新药，否则效率必然很低下，必然会导致人力物力财力的大量投入却得不到成效的结果，这样就要求药学研究的各个方向进行合作，共同进行药物的开发工作。目前为止，还没有一种金属β内酰胺酶在临床上使用，但是在科研中发现有一些物质能够对其活性产生抑制，相信，随着对该类酶作用机理的认识进一步加深，一定会有有效的抑制剂上市，来缓解细菌抗药性的问题。而这方面的研究必然很有前景。参考文献：[1]A.I.AnzellottiandN.P.Farrell，Zincmetalloproteinsasmedicinaltargets.ChemicalSocietyReviews2008;37:1629–1651[2]CarineBebrone,Metallo-b-lactamases(classification,activity,geneticorganization,structure,zinccoordination)andtheirsuperfamily.biochemicalpharmacology2007;74:1686–1701[3]RobertM.Breecea,LeticiaI.Llarrullb,MarianaF.Tionib,AlejandroJ.Vilab,DavidL.Tierney,X-rayabsorptionspectroscopyofmetalsitespeciationinthemetallo-β-lactamaseBcIIfromBacilluscereus.JournalofInorganicBiochemistry2012;111:182-186[4]陈辉，沈秉正，周亚丽，陈姣，郑珩,金属β-内酰胺酶催化机制的研究进展.国外医药抗生素分册2011;32:245-252[5]FátimaFonseca1,2,ElizabethH.C.Bromley3,MariaJoséSaavedra4,AntónioCorreia1andJamesSpencer2,CrystalStructureofSerratiafonticolaSfh-I:ActivationoftheNucleophileinMono-ZincMetallo-β-Lactamases.JournalofMolecularBiology2011;411:951-959[6]RobertM.Breecea,LeticiaI.Llarrullb,MarianaF.Tionib,AlejandroJ.Vilab,D