生物芯片与高通量筛选技术

生物芯片与高通量筛选技术主要内容生物芯片基因芯片（DNA芯片）蛋白质芯片（ProteinChips）细胞芯片组织芯片高通量筛选生物芯片生物芯片(biochip)是指采用微量点样等方式,将核酸片段、多肽分子、组织切片和细胞等生物样品有序地固定于支持物(如玻片、硅片、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二维阵列,然后与已标记的待测生物样品中的靶分子进行杂交、或用免疫组织化学、原位杂交等技术使待检分子可视化,最后通过特定的仪器如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影像机(CCD)对可视化信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的相对数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物,且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术,所以称之为生物芯片技术。生物芯片根据芯片上固定的生物物质的不同,生物芯片分为基因芯片(Genechip)、蛋白质芯片(proteinchip)、细胞芯片(cellchip)、组织芯片(tissuechip);如芯片上固定的是寡核苷酸或DNA,就称为基因芯片或DNA微阵列(DMAMicroarray);又如芯片上固定的是组织,就称为组织芯片。基因芯片（GeneChips）定义：就是按特定的排列方式固定有大量基因探针/基因片段的硅片、玻片、塑料。基因芯片技术是高效地大规划获取相关生物信息的重要手段。应用领域:主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序。基因芯片作用原理采用高速打印或光刻合成技术可在硅片、玻璃或尼龙膜上制造DNA微阵列即基因芯片；样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子,与微阵列杂交后通过荧光扫描仪器扫描及计算机分析即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。FlowchartofcDNAmicroarray基因制备方法分为两大类:一类是原位合成;一类是直接点样；原位合成适用于寡核苷酸;直接点样多用于大片段DNA,有时也用于寡核苷酸,甚至mRNA。原位合成有两种途径。一是光刻法;一是压电打印法。光刻法可以合成30nt左右,打印法可以合成40250nt,光刻法每步缩合率较低,一般说喷印法特异性应比光刻法高。此外,喷印法不需特殊的合成试剂。与原位合成法比较点样法较简单,只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻离片或其它材料上即可。芯片的种类电子芯片：带有阳电荷的硅芯片、芯片经热氧化,制成1mm×1mm的阵列、每个阵列含多个微电极,在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池。将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上,在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。三维芯片：三维生物芯片实质上是一块显微镜载玻片,其上有10,000个聚乙烯酰胺凝胶条,每个凝胶条可用于靶DNA,RNA和蛋白质的分析。先把已知化合物加在凝胶条上,再用3cm长的微型玻璃毛细管将待测样品加到凝胶条上。每个毛细管能把小到012nl的体积打到凝胶上。基因芯片应用基因表达谱分析新基因发现基因突变及多态性分析基因组文库作图疾病诊断和预测药物筛选基因测序基因表达谱分析基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以1:300,000水平出现的mRNA,且易于同时检测成千上万的基因。Lockhart等人对芯片技术定量检测基因表达及其敏感性、特异性进行了研究。在阵列的杂交实验中,从克隆cDNA文库或直接从细胞mRNA制备标记RNA靶,用于杂交的RNA靶通过体外转录反应掺入荧光素标记的核糖核苷酸制备,然后随机地将该RNA靶裂解为平均50—100个碱基大小的片段,样品与阵列杂交30分钟到22小时,阵列的荧光影像用特制的扫描共聚焦显微镜检测。新基因发现定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶等方面是很有价值的。如该技术在炎症性疾病类风湿性关节炎(RA)和炎症性肠病(IBD)的基因表达研究中,由RAIBD组织制备探针,用Cy3和Cy5荧光素标记,然后与靶cDNA微阵列杂交,可检测出炎症疾病诱导的基因如TNF－或粒细胞集落刺激因子,同时发现一些以前未发现的基因如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子。DNA序列分析人类基因组计划的实施促进了更高效率的、能够自动化操作的测序方法的发展。芯片技术中杂交测序(SBH)技术及邻堆杂交(CSH)技术一种新的高效快速测序方法。用含65，536个8聚寡核苷酸的微阵列,采用SBH技术,可测定200bp长DNA序列,采用67,108,864个13个聚寡核苷酸的微阵列,可对数千个碱基长的DNA测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高,但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性,降低了杂交准确性。CSH技术弥补了SBH技术存在的弊端,CSH技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度,加强了序列准确性,可进行较长的DNA测序。突变体和多态性的检测SHB技术可大规模地检测和分析DNA的变异及多态性。Guo等人利用结合在玻璃支持物上的等位基因特异性寡核苷酸(ASOs)微阵列建立了简单快速的基因多态性分析方法。将ASOs共价固定于玻璃载片上,采用PCR扩增基因组DNA,其一条引物用荧光素标记,另一条引物用生物素标记,分离两条互补的DNA链,将荧光素标记DNA链与微阵列杂交,通过荧光扫描检测杂交模式,即可测定PCR产物存在的多种多态性,该方法对人的酪氨酸酶基因第4个外显子内含有的5个单碱基突变进行分析,结果显示单碱基错配与完全匹配的杂交模式非常易于区别。这种方法可快速、定量地获得基因信息。疾病诊断和预测CancerArray肿瘤基因芯片生长因子基因芯片肿瘤转移基因芯片染色体稳定和DNA修复基因芯片雄性激素信号通路与前列腺癌基因芯片肿瘤信号转导基因芯片肿瘤药物耐受和代谢基因芯片血管生成基因芯片乳腺癌和雌激素受体信号通路基因芯片癌通路发现者基因芯片基因芯片－状况自从1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片。美国的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、欧洲各国都积极开展DNA芯片研究工作；摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资开展芯片研究。预计在今后五年内生物芯片销售可达200-300亿美元；据《财富》杂志预测(97.3)，在21世纪，生物芯片对人类的影响将可能超过微电子芯片。基因芯片－状况我国在生物芯片研究方面刚刚起步，98年10月，中科院将基因芯片列为“”九五”特别支持项目，利用中科院在微电子技术、生化技术、物理检测技术方面的优势，组织跨所、跨学科合作。现在在微阵列芯片和基于MEBS的芯片方面有大的突破，在DNA芯片设计、基片修饰、探针固定、样品标记、杂交和检测等方面的技术都有较大的进展，已研制出肝癌基因差异表达芯片、乙肝病毒多态性检测芯片、多种恶性肿瘤病毒基因芯片等有一定实用意义的基因芯片和DNA芯片检测仪样机。蛋白质芯片蛋白质芯片技术是指把制备好的蛋白质样品固定于经化学修饰的玻片、硅片等载体上,蛋白质与载体表面结合,同时仍保留蛋白质的物化性质和生物活性。蛋白质芯片是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。蛋白质芯片主要分两种:1）一种类似于ＤＮＡ芯片,即在固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵,可特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。2）另一种就是微型化的凝胶电泳板。在电场作用下,样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来,经喷雾直接进入质谱仪中进行检测,以确定样品中蛋白质的分子量及种类。抗体蛋白质芯片原理原理蛋白质芯片是将已知蛋白点印在固定于不同种类支持介质上,制成由高密度的蛋白质或多肽分子的微阵列组成蛋白微阵列,其中每个分子的位置及序列为已知,并将待测蛋白质与该芯片进行孵育反应,再将荧光标记的蛋白质与芯片蛋白质复合物反应,当荧光标记的靶分子与芯片上的分子结合后,可通过激光扫描系统或电荷偶联照像系统(ＣＣＤ）,对荧光信号的强度进行检测,进一步对杂交结果进行量化分析,检测蛋白质的存在情况。蛋白质芯片应用蛋白质芯片应用疾病诊断和疗效判定研究蛋白质的相互作用发现药物或毒物作用靶位和作用机制发展日开发出廉价蛋白质芯片：开发成功可迅速检测癌症等疾病的廉价蛋白质芯片。把目前数十万日元一个的蛋白质芯片价格降到了仅为几千日元。预计这种芯片在4年内可以使用。光学蛋白质芯片是一种基于椭圆偏振光原理，利用抗原和抗体以及受体与配体特异性的结合，将分子间的相互作用转换为可直接读取的灰度值，对检测样品进行定量检测的方法。它由于无须对探针分子进行标记，因此有利于对蛋白质进行活性分析。应用后冠心病检测加速。发展中国科学家研制的丙型肝炎蛋白质芯片获国家药监局颁发的生物制品一类新药证书。这不仅是我国的第一个获新药证书的硅基材料蛋白质芯片，也是迄今为止世界上惟一得到政府药品监督管理机构颁发新药证书的蛋白质芯片。两英寸大小的蛋白质芯片已由深圳益生堂生物企业有限公司投产。只需要２微升（一滴血的十分之一）血清或血浆，１小时后就能检测出结果。而每次的检测费用只有１００元左右。细胞芯片新型的细胞芯片,其原理是应用细胞膜表面不同的抗原物质,与结合在玻片上的不同抗体发生特异性结合,通过自动捕获能力将所获细胞固定在特定区域,以此对淋巴瘤细胞进行诊断和分类。细胞芯片的制作:每种抗体与pH10－12的Tris2HCl缓冲液等体积稀释,通过生物芯片点样仪自动点样,将8种抗体分别点在醛基玻片上的各自区域,每一抗体点4个点,直径约2mm左右,形成4×8微阵列。点样后迅速将玻片置于湿盒中,4℃冰箱水化,过夜。细胞芯片应用疾病诊断胸腔液中淋巴瘤细胞检测发展最近出现了一种细胞微阵列芯片，他是将不同的质粒DNA点在玻璃片上做成质粒DNA芯片，接着在脂质转染试剂处理好的芯片上培养细胞，被转染的细胞因此获得了外源DNA赋予的新性状，因此也称为反向转染(reversetransfection).这种技术不但可以用于cDNA、融合肽或RNA分子的分析，而且还可以用于研究一些细胞因子、化学抑制剂或放射性标记对基因表达的影响.组织芯片Kononen等(1998)年在《自然》杂志上首次报道了组织芯片这一高通量的技术。组织芯片技术可以将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具。它使科研人员第一次有可能同时对几百甚至上千种正常或疾病以及疾病发展不同阶段的自然病理生理状态下的组织样本，进行某一个或多个特定的基因，或与其相关的表达产物的研究。应用如Kononen等使用标准免疫组化方法利用组织芯片技术研究了645例各种乳腺癌组织标本，试验数据与传统病理切片相应研究结果完全一致；同时他们还发现有关p53等6种基因的检测结果表明，新鲜与石蜡包埋的组织标本的检测结果没有差异。Hedenfalk等结合组织芯片技术和基因芯片技术检测了原发性乳腺癌及组织标本。Hoos等用组织芯片技术对59例成纤维细胞瘤进行免疫表型分析。Mucci等用组织芯片证实了神经内分泌因素与前列腺癌进展的关系。高通量筛选（HighThroughputScreen，HTS）新药发现细胞分析平台HTSHTS90年代初期,一个实验室采用传统的方法,借助20余种药物作用靶位,一年内仅能筛选75000个样品;到了1997年HTS发展的初期,采用100余种靶位,每年可筛选1000000个样品;而到1999年,由于HTS的进一步完善,每天的筛选量就高达100000种化合物[2],因而,称之为超高通量筛选(ultrahigh-throughputscreening)。这种新的飞跃,将大大加速新药发现的速度。HTS高通量药物筛选技术是20世纪80年代后期发展起来的一种用于寻找新药的高新技术,由于该技术的快速、高效等特点,受到国际药物研究机构的极大重视。高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机