生黄合剂对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡及相关基因baxbcl-2mRNA的影响

中国组织工程研究第20卷第27期2016–06–30出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJune30,2016Vol.20,No.27ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4049·研究原著·陈龙，男，1977年生，河北省承德市人，满族，2001年承德医学院毕业，硕士，讲师，主要从事中药抗衰老方面的研究。中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)27-04049-06稿件接受：2016-04-16生黄合剂对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡及相关基因bax、bcl-2mRNA的影响陈龙，田焕娜，高玉峰(承德医学院，河北省承德市067000)引用本文：陈龙，田焕娜，高玉峰.生黄合剂对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡及相关基因bax、bcl-2mRNA的影响[J].中国组织工程研究，2016，20(27):4049-4054.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.014ORCID:0000-0003-0243-2424(陈龙)文章快速阅读：文题释义：心肌缺血再灌注损伤：指心肌组织在遭受缺血、缺氧性损伤一定时间后恢复血液灌流，不仅不能使心肌组织功能恢复，反而使缺血心肌发生比再灌注前更严重的损伤。虽然早期恢复血液灌注是减轻心肌组织缺血性损伤的一种重要手段，但由于血流恢复再灌注后，中性粒细胞大量黏附、聚集并在心肌组织浸润，加上大量氧自由基的生成以及钙超载、高能磷酸化合物缺乏、内皮素的作用下，使心肌组织损伤更加严重。细胞凋亡：为了维持内环境稳定，由基因控制的活体内个别细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡在形态和生化特征上与细胞坏死都有不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程，在成熟细胞新旧交替、萎缩、老化、炎症等生理、病理过程中都发挥了不可替代的作用。摘要背景：生黄合剂由中药生脉饮和黄芩茎叶总黄酮组成，已有研究表明其通过抗炎、调节免疫功能等对心肌缺血有保护作用，但对缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的作用机制尚未阐明。目的：探讨生黄合剂对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡及相关基因bcl-2、baxmRNA表达的影响。方法：将36只SD大鼠随机分为6组，即生黄合剂低、中、高剂量组、阳性药物对照组、空白组、模型组，每组6只，分别给药7d后，建立心肌缺血再灌注损伤模型。用TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况，RT-PCR法检测缺血再灌注区心肌bax、bcl-2mRNA的表达。结果与结论：①与模型组比较，生黄合剂治疗组bcl-2mRNA表达显著升高(P0.05)，baxmRNA表达显著降低(P0.05)，使bcl-2/bax比值升高，心肌细胞凋亡指数明显降低(P0.05)；②结果证实，生黄合剂对大鼠心肌组织缺血再灌注有保护作用，其机制可能是通过上调bcl-2mRNA的表达、下调baxmRNA的表达，提高bcl-2/bax比值，从而起到抑制心肌细胞凋亡。关键词：实验动物；心肺及血管损伤动物模型；生黄合剂；大鼠；心肌缺血再灌注；细胞凋亡；bcl-2基因；bax基因心肌缺血再灌注模型的建模流程SD大鼠36只6只空白30只造模构建心肌缺血再灌注损伤模型6只阳性药物对照组6只生黄合剂低剂量组6只生黄合剂中剂量组6只生黄合剂高剂量组6只检测心肌细胞凋亡阻断冠状动脉左前降支阻断冠状动脉左前降支+生黄合剂预处理阻断冠状动脉左前降支+复方丹参滴丸预处理陈龙，等.生黄合剂对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡及相关基因bax、bcl-2mRNA的影响P.O.Box10002,Shenyang1101804050主题词：心肌缺血；细胞凋亡；组织工程InfluenceofSheng-Huangmixtureoncardiocyteapoptosisandbaxandbcl-2mRNAexpressioninaratmodelofischemia-reperfusioninjuryChenLong,TianHuan-na,GaoYu-feng(ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,HebeiProvince,China)AbstractBACKGROUND:Sheng-HuangmixtureincludingChinesemedicineShengmaiDecoctionandtotalflavonoidsofstemsandleavesofradixhasbeenshowntoresistinflammation,regulateimmunefunction,andprotectischemicmyocardialtissues.However,itseffectontheapoptosisofcardiacmusclecellsafterischemia/reperfusioninjuryremainsunclear.OBJECTIVE:ToinvestigatetheeffectsofSheng-Huangmixtureoncardiocyteapoptosisandbaxandbcl-2mRNAexpressioninratswithischemia-reperfusioninjury.METHODS:Thirty-sixSprague-Dawleyratsweredividedrandomlyintosixgroups:low-dose,moderate-doseandhigh-doseSheng-Huangmixture,positivecontrol,blankandmodelgroups(n=6).After7daysofadministration,modelsofmyocardialischemia-reperfusioninjurywereestablished.TUNELwasusedtodetectmyocardialapoptosis.RT-PCRwasutilizedtomeasurebaxandbcl-2mRNAexpressionintheischemicandreperfusionregion.RESULTSANDCONCLUSION:(1)Thebcl-2mRNAexpressionwassignificantlyhigherintheSheng-Huangmixturegroupthaninthemodelgroup(P0.05),butbaxmRNAexpressionwassignificantlylower(P0.05).Thus,bcl-2/baxratioincreased.Inaddition,apoptosisindexwasmoresignificantlydecreasedintheSheng-Huangmixturegroup(P0.05).(2)ResultsdemonstratedthatSheng-Huangmixturecanprotectratmyocardiumagainstischemia/reperfusioninjury,andeffectivelyincreasethebcl-2/baxratioandinhibittheapoptosisofcardiomyocytes,andtheunderlyingmechanismismediatedbyup-regulatingbcl-2mRNAexpressionanddown-regulatingbaxmRNAexpression.Subjectheadings:MyocardialIschemia;Apoptosis;TissueEngineeringCitethisarticle:ChenL,TianHN,GaoYF.InfluenceofSheng-Huangmixtureoncardiocyteapoptosisandbaxandbcl-2mRNAexpressioninaratmodelofischemia-reperfusioninjury.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(27):4049-4054.0引言Introduction在中国，急性心肌梗死近年来发病率显著升高，其基本的治疗原则是恢复血流再灌注，但实验研究发现心肌组织缺血后在一定时间内恢复血流再灌注，反而加重心肌组织损伤，甚至使心肌组织发生不可逆性损伤，把这种现象称为心肌缺血再灌注损伤[1-4]。目前的研究发现，心肌缺血再灌注过程中可诱导心肌细胞凋亡，心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的重要形式之一，且是缺血再灌注时心肌细胞早期死亡的主要方式，细胞凋亡数目与缺血再灌注损伤的轻重有直接的关系[5-10]，所以抑制缺血再灌注时心肌细胞的凋亡对于防治心肌缺血再灌注损伤有重要的意义。已有大量研究发现心肌缺血再灌注后bcl-2基因家族在心肌细胞凋亡的调控中发挥着重要作用。生黄合剂由中药生脉饮和黄芩茎叶总黄酮组成，具有抗炎、调节免疫功能、抗氧化等作用，黄芩茎叶总黄酮与生脉饮合用效果强于单用的效果[11-14]，在心血管保护中发挥重要作用，但生黄合剂对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响及凋亡途径尚不完全清楚。实验建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况，RT-PCR法检测缺血再灌注区心肌细胞bax、bcl-2mRNA的表达，从分子水平探讨生黄合剂拮抗缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的作用机制。1材料和方法Materialsandmethods1.1材料1.1.1实验动物健康SD雄性大鼠36只，140d龄，体质量200-350g，购于北京大学医学部实验动物科学部。1.1.2主要试剂黄芩茎叶总黄酮(承德医学院中药研究所)，生脉饮(吉林敖东药业集团有限公司)，复方丹参滴丸(广州白云山制药总厂)，TUNEL试剂盒(罗氏诊断产品有限公司)，RT-PCR试剂盒(Takara公司)，Bax、Bcl-2陈龙，等.生黄合剂对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡及相关基因bax、bcl-2mRNA的影响ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4051兔抗鼠多克隆抗体(美国Santa公司)，Trizol总RNA提取试剂(Invitrogen公司)，琼脂糖(美国Santa公司)，引物及内参(上海生工生物工程公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术开发有限公司)，DNAMarker(大连宝生物公司，溴化乙锭(GIBRO公司)。1.2实验方法1.2.1动物分组、给药健康SD大鼠36只，随机分为6组，每组6只。生黄合剂低、中、高剂量组在手术前7d开始按5mL/(kg•d)灌胃不同剂量的生黄合剂(5mL/kg生脉饮分别溶解黄芩茎叶总黄酮18，36，72mg/kg)。空白组、模型组给予相同体积生理盐水。阳性药物对照组按135mg/kg给予复方丹参滴丸。给药结束后，空白组分离冠状动脉左前降支后只穿线不结扎，30min后将线拨出，其他各组分离左冠状动脉前降支，结扎30min，然后剪断结扎线，再灌注2h。1.2.2制备心肌缺血再灌注损伤模型3g/L戊巴比妥钠按10mL/kg的剂量对大鼠进行腹腔注射麻醉，取仰卧位固定，颈部正中切口，气管插管，小型呼吸机控制呼吸；胸部消毒剃毛，于左胸3至4肋间切开胸壁，暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支，结扎30min；然后剪断结扎线，再恢复血流灌注2h，空白组分离冠状动脉左前降支后只穿线不结扎，30min后将线拔出，实验中观察心尖部颜色改变及心电图变化，以心电图