第七章鞭毛虫

PAGE2第七章鞭毛虫鞭毛虫隶属于肉足鞭毛门（PhylumSarcomastigophora）的动鞭纲（ClassZoomastigophorea），以鞭毛作为运动细胞器，有一根或多根鞭毛。某些种类有阿米巴型，可有或无鞭毛。种类繁多，分布很广，生活方式多种多样。营寄生生活的鞭毛虫主要寄生于宿主的消化道、泌尿道、血液及组织内。生活过程以分裂法繁殖。有些种类尚可形成包囊。寄生人体的鞭毛虫常见的有十余种，其中利什曼原虫、锥虫、蓝氏贾第鞭毛虫及阴道毛滴虫对人体危害较大。第一节杜氏利什曼原虫利什曼原虫（Leishmaniaspp）属于动基体目（OrderKinetoplastida），锥虫亚目（SuborderTrypanosomatina），锥虫科（FamilyTrypanasomatidae），利什曼属（GenusLeishmania）。生活史有前鞭毛体（promastigote）及无鞭毛体（amastigote）两个时期，前者寄生于节肢动物（白蛉）的消化道内，后者寄生于脊椎动物的单核巨噬细胞内，通过白蛉传播。由利什曼原虫感染而引起的疾病，称利什曼病（leishmaniasis）。利什曼病广泛分布在亚、欧、非、拉美等洲的许多国家。是对人体危害严重的人兽共患寄生虫病。据TDR（1989）估计全球患病人数在1千2百万以上，每年有4百万新感染病例出现；1998年死于本病的人数为4.2万人。根据临床损害组织不同，利什曼病可分为三种不同类型：①内脏利什曼病（visceralleishmaniasis,VL），在印度，患者皮PAGE2肤常有暗的色素沉着，并有发热，故称（kala-azar），即黑热病，由杜氏利什曼原虫[Leishmaniadonovani(Laveran&.Mesnil,1903)Ross,1903]侵害内脏器官（如脾、肝、骨髓等）而致病，如未得到及时治疗，常可致死。②粘膜皮肤利什曼病（mucocutaneousleishmaniasis,MCL），由巴西利什曼原虫（LeishmaniabraziliensisVianna,1911）所致。原虫寄生于皮肤内引起皮肤病变，也可经淋巴或血液侵入鼻咽部粘膜内，可致粘膜病变。严重者鼻中隔、甚至喉和气管的软骨也有损伤。分布于中、南美洲，非洲的埃塞俄比亚和苏丹也有病例报告。③皮肤利什曼病（cutaneousleishmaniasis,CL），流行于非洲、拉丁美洲、西南亚、地中海盆地和前苏联部分地区。由热带利什曼原虫[Leishmaniatropica(wright,1903),Luhe,1906]和墨西哥利什曼原虫[Leishmaniamexicana(biagi,1953)Garnham,1962]所致。热带利什曼原虫又可分为两个独立的亚种，即硕大利什曼原虫(Leishmania.major)与热带利什曼原虫（Leishmania.tropica），两个亚种在形态上，临床表现及流行病学上各有特点。我国黑热病是由杜氏利什曼原虫引起。【形态】不同种株利什曼原虫的形态与结构均无明显差别，在其生活史中由于宿主和环境的不同，有无鞭毛体和前鞭毛体两种不同的形态。1．无鞭毛体（amastigote）通常称利杜体（Leishman-Donovanbody,LDbody），寄生于人和其他哺乳动物的吞噬细胞内。虫体很小，卵圆形，大小2.9～5.7×1.8～4.0μm。瑞氏染液染色后，原虫细胞质呈淡蓝或淡红色。内有一个较大而明显的圆形核，呈红色或淡紫色。动基体(kinetoplast)位于核旁，着色较深，细小、杆状。易于与其他原虫相区别。在更高倍数放大时，可见虫体前端从颗粒状的基体（basal图7-1杜氏利什曼原虫PAGE2body）发出一根丝体（rhizoplast）。基体及根丝体在普通显微镜下难以区分。在透射电镜下，虫体由内外两层表膜包被。每一层为一个单位膜。在内层表膜下有排列整齐的管状纤维，称为膜下微管（subpellicularmicrotubule）。微管数目、直径、间距等在种、株鉴定上有一定意义。虫体前端的表膜向内凹陷，形成一袋状腔，称为鞭毛袋，内有一根短的鞭毛（即光镜下的根丝体）。基体为中空圆形。动基体为腊肠状，其内有一束与长轴平行的纤丝，该纤丝由DNA组成。其它线粒体呈泡状或管状，内有少数排列不整齐的板状嵴。类脂体圆形或卵圆形。内质网不发达呈管状或泡状。核一个，卵圆形，大小约1.5×1.0μm。核膜两层，可见核孔。核仁1～2个。2．前鞭毛体（promastigote）寄生于白岭消化道。成熟的虫体呈梭形或长梭形，前端有一根伸出体外的鞭毛，为虫体运动器官。虫体大小为14.3～20×1.5～1.8μm，核位于虫体中部，动基体在前部。基体在动基体之前，鞭毛即由此发出。活的前鞭毛体运动活泼，鞭毛不停地摆动，常以虫体前端聚集成团，排列成菊花状。体外培养有时也可见到粗短形前鞭毛体和梭形前鞭毛体，这与不同的发育程度有关（图7－2）。透射电镜可见虫体前端有一袋状凹陷的鞭毛袋，内有鞭毛。鞭毛表面有薄膜两层。鞭毛的横切面上有9对周围纤维和两根中央纤维，它们都与基体相连。动基体与核的超微结构与无鞭毛体相似。利什曼原虫的DNA及核外DNA，后者占DNA总量的10～25%，主要集中在动基体内，故称K-DNA。它是动基体目（Kinetoplastida）原虫特有的线粒体DNA，是由许多微环（minicircle）和少数大环（图7－2）杜氏利什曼原虫无鞭毛体超微结构图PAGE2（maxicircle）所组成的网状结构。微环容易分离、提纯，且有不同属、种甚至株DNA序列同源性的差异。如Southern杂交试验显示，同株原虫微环之间同源性大；同种异株微环间，同源性较前者为小；不同种之间只有部分同源；而不同属微环间，则只有少数同源序列，即仅13对碱基序列同源。分析k-DNA微环的DNA序列的同源性，为从本质上区分利什曼原虫不同的种、株，提供了新手段。【生活史】杜氏利什曼原虫生活史需要两个宿主即白蛉和人或哺乳动物。1当雌性白蛉叮剌病人或受感染的动物宿主时，血液或皮肤内含无鞭毛体的巨噬细胞被吸入胃内，经24小时，无鞭毛体发育为早期前鞭毛体。此时虫体呈卵圆形，鞭毛也开始伸出体外。48小时后发育为粗短的前鞭毛体或梭形前鞭毛体，体形从卵圆形逐渐变为宽梭形或长度超过宽度3倍的梭形，此时鞭毛亦由短变长。第3、4天出现大量成熟前鞭毛体，长11.3～15.9μm（有时可达20μm），活动力明显加强，并以纵二分裂法繁殖。在数量剧增的同时，虫体逐渐向白蛉前胃、食道和咽部移动。一周后具感染力的前鞭毛体大量聚集在口腔及喙。当白蛉叮剌健康人时，前鞭毛体随白蛉唾液进入人体。在离体培养中可见前鞭毛体分裂繁殖是从原鞭毛附近伸出一根新的鞭毛开始，虫体逐渐变粗短，长度仅为宽的1～2倍。有的虫体先从前端开始纵裂，继之后端也出现裂隙，虫体在中部断裂为两个虫体。也有虫体从前向后顺序裂开，最后在后端断裂为两个虫体。分裂后虫体逐渐变长呈梭形。2．在人体内发育感染有前鞭毛体的雌性白蛉叮刺人体吸血时，前鞭毛体随白蛉分泌的唾液进入人体的皮下组织。一部分前鞭毛体可被多核白细胞吞噬消灭；一部分则进入巨噬细胞。原虫进入巨噬细胞PAGE2后，逐渐变圆，失去其鞭毛的体外部分，向无鞭毛体期转化。此时巨噬细胞内形成含虫空泡。无鞭毛体在巨噬细胞内不但可以存活，且能进行分裂繁殖。电镜观察可见无鞭毛体分裂从新鞭毛轴丝形成和动基体DNA纤丝伸长开始，以后DNA纤丝出现裂隙，继之细胞核分裂，虫体一侧表膜出现凹陷，新膜下微管和表膜先后形成，并向细胞内伸入，包绕两个分裂的虫体，完成细胞分裂。无鞭毛体的大量繁殖，最终巨噬细胞破裂。游离的无鞭毛体又进入其他巨噬细胞，重复上述增殖过程（图7－3）。利什曼原虫入侵巨噬细胞的机制近年来体外试验研究证明利什曼原虫首先粘附于巨噬细胞，再进入该细胞内。粘附的途径可分为二种：一种为配体—受体结合途径，一种为前鞭毛体吸附的抗体和补体与巨噬细胞表面的Fc或C3b受体结合途径。在调整或封闭这些受体后，可大大减少前鞭毛体与巨噬细胞的结合。粘附后原虫则随巨噬细胞的吞噬活动而进入巨噬细胞。前鞭毛体的能动性只增加接触机会，并非它主动入侵巨噬细胞。受感染的巨噬细胞表面，有利什曼原虫抗原存在。前鞭毛体质膜中的分子量为63KDa糖蛋白（GP63）系多种利什曼原虫表面抗原的主要成分。GP63具有部分保护作用。用GP63脂化后免疫动物，使宿主获得免疫力，可抵抗利什曼原虫的感染。他进一步研究这种免疫保护作用产生的抗原结构基础发现，GP63是巨噬细胞上C3b受体的配体，利什曼原虫前鞭毛体可通过GP63多肽链上的Arg-Gly-Asp即所谓的“粘性”序列与巨噬细胞上C3b结合，从而介导前鞭毛体入侵巨噬细胞。用前鞭毛体的mRNA构建cDNA文库，在表达性载体λgtll中表达，并以kala-azar病人血清筛选，结果获得了包含GP63基因的克隆。利什曼原虫前鞭毛体还可从体表脱落（图7－3）杜氏利什曼原虫生活史PAGE2一种糖耦合物，称排泄因子（excretoryfactor,EF）。GP63或EF能与巨噬细胞表面结合从而侵入巨噬细胞。两种发育阶段的转化机制有学者曾通过控制培养基成份、pH值和培养温度在无氧培养中完成墨西哥利什曼原虫的生活史各种发育阶段的循环，但利什曼原虫的前鞭毛体转化为无鞭毛体的机制目前尚未完全阐明。一般认为可能是微小环境的改变，如pH，温度等及原虫所需营养物质和宿主对原虫作用等因素的影响所致。实验证明，前鞭毛体发育以27℃为宜，无鞭毛体则需要35℃环境。它们的抗原性也有明显差异，除存在共同性区带外，它们还各有不同的期特异抗原区带。总蛋白量、蛋白酶、核酸酶和分泌性磷酸酶以及微管蛋白均存在较大的差异。机体对利什曼原虫的杀伤利什曼原虫在巨噬细胞内寄生和繁殖，其抗原可在巨噬细胞表面表达。宿主对利什曼原虫的免疫应答属细胞免疫，其效应细胞为激活的巨噬细胞；通过细胞内产生的活性氧杀伤无鞭毛体。使含有无鞭毛体的巨噬细胞坏死并清除虫体，这种现象在皮肤利什曼病表现明显。近年研究结果，提示抗体也参与宿主对利什曼原虫的免疫应答。【致病】内脏利什曼病（visceralleishmaniasis）人体感染杜氏利什曼原虫后，经过4～7个月或最长10～11个月的潜伏期，即可出现全身性症状和体征。患者的主要症状和体征为长期不规则发热，常呈双峰热型（上、下午各有一次高热），伴脾、肝、淋巴结肿大，消瘦、贫血，白细胞及血小板减少，血清丙种球蛋白明显增高，白/球蛋白比率倒置，蛋白尿和血尿，患者常发生鼻衄和齿龈出血，晚期病人面部两颊可出现色素沉着。由于全血细胞减少，免疫受损，易并发各种感染性PAGE2疾病。如肺炎等，常可导致患儿死亡。急性粒细胞缺乏症是黑热病的另一严重并发症，如不及时治疗，患者病情不断恶化，则大都在患病后1～2年内并发其他疾病而死亡。无鞭毛体在巨噬细胞内大量繁殖，使巨噬细胞大量破坏和增生，从而导致肝、脾、淋巴结肿大，其中脾肿大最为常见（95%）。由于浆细胞大量增生和患者肝功受损使患者白蛋白生成减少，从而导致白/球蛋白的比率倒置。此外，血液中红细胞、白细胞和血小板都减少，这是因为患者脾功能亢进，再加上免疫溶血，血细胞遭到大量破坏所致。患黑热病时出现免疫受损，患者不仅有特异性细胞免疫的抑制，而且对其它病原生物产生细胞免疫和体液免疫反应的能力降低，即非特异性抑制，这可能与患者体内原虫繁殖快速，产生抗原太多，机体处于免疫无反应状态有关。人体对杜氏利什曼原虫无先天免疫力，黑热病多见于婴儿及儿童。但黑热病愈后则可产生稳固的获得性免疫，能够抵抗同种利什曼原虫的再感染。黑热病患者治愈后利什曼素皮内试验（LDT）阳性呈一曲线，20～29年后达到高峰，以后呈下降趋势，阳性反应可保持50余年之久，反应强度并不减弱。可见患者治愈后，可获得终身免疫。皮肤型黑热病（post-kala-azardermalleishmaniasis,PKDL）部分黑热病患者在用锑剂治疗过程中或在治愈后数年甚至十