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第三章中药发酵工艺条件发酵技术是利用微生物的某种特性,通过现代化的技术手段进行工业化大规模生产的技术。目前由于我国人口过多,资源消费排在世界前列,加之资源短缺,所以应大力发展发酵技术。通过该项技术大规模地生产某种产品,将有助于解决我国资源短缺的问题。伴随着现代生命科学技术和分子生物学的迅猛发展,发酵技术及相关应用领域的研究也越来越活跃,已深入到食品、医药卫生、农业生产、轻工业等各领域中,特别是在中草药的发酵方面取得了很大的进展。例如,药用菌类植物是我国药用植物中的重要组成部分,在民间因其独特的防病、治病效果而有着悠久的历史;同时药用菌类植物还常常被作为中成药的原料药,所以具有非常广阔的应用前景。但目前我们已经注意到,野生型药用菌类植物已经被极度采集,致使资源愈来愈少,国内外市场资源紧缺。因此,如果单单通过野外采集等途径获得,很难满足医药市场的需求,而且价格十分昂贵。如采用发酵工程技术,给予适宜的条件来培养这些菌类植物,则可以达到快速、大规模生产的目的,这显然是一条非常好的技术路线。我国历史上早已有药用真菌的固体培养,如神曲的培养等。近几十年来,为适应市扬的需求,采用发酵技术生产药用真菌、菌丝体及其他代谢产物有了很大的发展。如传统名贵中药冬虫夏草、云芝、灵芝、蜜环菌等都已经投入到大规模的工业化连续生产中,发酵周期短,生产效益高。同时在发酵过程中,除了使菌丝体大量增殖,在发酵液中还可得到多糖、生物碱、酶、核酸等多种具有生物活性的次生代谢产物。通过研究表明,这些物质具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、调节免疫等多种功效。利用发酵技术生产这些药用活性成分,还可进一步使药品生产规范化,药源质量、数量稳定,有利于这些药物的相关制剂打入国际市场。可见发酵技术在中医药中的应用已经有了一个良好的开端,引起了人们的极大关注。第一节培养基的选择和确定培养基是按照微生物的生长、繁殖、代谢的需要,由各种营养物质按一定比例组合而成的混合体。微生物对培养基中营养物质的利用是通过向外界分泌大量的酶,将周围环境中大分子如糖类、脂肪、蛋白质等分解成小分子的营养物质,借助于细胞膜的跨膜物质转运功能从外界不断地吸收小分子的营养物质,一方面利用这些营养物质合成新的自身所需要的营养物质,另一方面利用这些营养物质获得所需要的能量。可见,培养基的构成及其配比是否恰当对生产菌种的生长、繁殖及代谢产物的合成,甚至对代谢产物的分离、提取、纯化及最终成品的产量和质量都将产生相当大的影响。一个良好的培养基,必须能够提供微生物生长、繁殖所需的各种营养成分,充分发挥生产菌种的生物合成能力,获得最佳的生产效果,从而提高发酵生产水平;一个好的培养基,其营养物质的配备比例,要通过长期的生产实践摸索,不断调整才能完善;一个好的培养基,其组成成分不是一成不变的,要根据不同菌种的特征、发酵生产中的不同阶段和菌种细小的变化情况加以适当调整。如种子生产中就常常通过调整培养基组成的方法来获得优质的孢子,提高发酵生产水平。一、培养基的组成在工业生产和科研工作中,无论哪一种培养基,都应满足微生物的生长、繁殖和发酵所需要的各种营养物质,而这些营养物质也就是培养基的组成。培养基中的原材料归纳起来有碳源、氮源、无机盐、水、生长因子和前体物质等几大类。其中碳源是组成培养基的主要成分之一,它是碳水化合物合成的原料,为微生物生命活动提供所需要的能量;氮源也是组成培养基的主要成分之一,是蛋白质和核酸合成的主要原料。但在实际工作中,由于微生物细胞的种类不同,同一生产过裎的阶段不同、培养目的的不同,故所选用的培养基成分还是有一定差异的。二、培养基的类型根据微生物生长、繁殖和发酵的不同要求,培养基的成分和各成分的含量也是不同的,所以培养基的种类很多。据估计目前约有数千种培养基。随着生物科学的飞速发展,培养基的种类也在不断增加。一般来说根据培养基成分、物理状态、不同的使用目的以及生产工艺的要求等可分为以下若干类型。1.根据培养基的成分进行分类分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基。(1)合成培养基合成培养基是利用化学成分和数量完全清楚的物质配制而成的。由于微生物对营养要求的不同,它可以完全由无机盐或无机盐加有机化合物(氨基酸、糖、嘌呤、维生素等)组成。这种合成培养基的配方成分都是已知的,所以只要配制过程操作严格,各批培养基的质量可做到稳定一致。由于这种培养基的化学成分清楚、组成成分精确、重复性强,所以可以减少不能控制的因素,适用于某些定量工作的研究。但合成培养基的成本较高、价格较贵,其价格相当于同类天然培养基的几倍甚至几十倍,因此,合成培养基一般只能在研究工作中使用。同时,一般微生物在合成培养基上生长较慢,有些微生物营养要求复杂,在合成培养基上是不能生长的。(2)天然培养基由天然物质制成,对于这些天然物质的化学成分还不完全了解,如蛋白胨、普通牛肉汤、玉米浆等。这就造成了用此类物质配成的培养基很难做到在不同批次之间质量上的稳定性,因此,在选用原料时务必标明其名称及批次。同时对不同来源的商品均应先做小试。虽然天然培养基存在这些缺点,但其成本较低,配制方便,营养丰富,适合于各类异养微生物的生长,而一般自养型微生物则不能生长。(3)半合成培养基在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐,或在合成培养基的基础上添加某些天然成分,如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基,其特点是能充分满足微生物的营养需要,大多数微生物都能在此培养基上生长、繁殖。因此,在微生物工业生产和科学研究中半合成培养基被广泛地应用。2.根据培养基的物理状态分类分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。(1)固体培养基是在培养基中加入凝固剂,如琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基大多用于微生物分离、鉴定、计数、菌种保存、抗菌药物的效价试验以及生物制品生产中的菌、疫苗制造等方面。如肉汤琼脂、营养琼脂等均属此类。(2)液体培养基液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀,微生物能充分接触和利用培养基中的养料,适于作生理方面研究。由于发酵率高,操作方便,也常被用于发酵工业大量生产和增菌培养。(3)半固体培养基是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于细菌动力学试验、菌种传代、菌种鉴定、测定噬菌体效价和保存及贮运标本等方面。如双糖铁培养基的高层部分,用以观察细菌有无动力。3.根据培养基用途分类分为加富培养基、选择性培养基、鉴别培养基和厌氧菌培养基。(1)加富培养基是在普通培养基中加入血、血清、动植物组织提取液或其他营养物质的一类营养丰富的培养基,用以培养营养要求比较苛刻的某些异养微生物。(2)选择性培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。在这类培养基中含有营养物(增菌剂)和抑菌剂(选择剂)。菌体接种于这类培养基后,由于抑菌剂的选择性抑制作用,使所要分离的目标菌能够得到较好的繁殖,而其他菌被抑制。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。例如,利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择性培养基,可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物。(3)鉴别培养基是在普通培养基中加入某种试剂或化学药品,微生物在培养基中生长时,可以产生某种代谢产物,随后代谢产物与培养基中加入的试剂或化学药品发生反应,产生非常明显的特征性变化,这样我们就可以利用这种特征性变化来鉴别不同类型的微生物了。(4)厌氧菌培养基厌氧菌体内缺乏有氧代谢所需要的各种酶如细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等,无法进行有氧代谢,因而在代谢过程中会导致自身代谢缺陷,并且厌氧菌在无氧酵解时所产生的能量不足,所以一般的培养基是无法满足厌氧菌正常生长的。为使厌氧菌能够正常生长、繁殖,必须制备氧化还原电势较低、具有特殊生长因子、营养成分丰富的培养基。这就是厌氧菌培养基。厌氧菌培养基是专供厌氧菌分离、培养和鉴别用的培养基。4.根据生产工艺要求分类分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。(1)孢子培养基孢子培养基是供制备孢子用的固体培养基。要求这种培养基能使孢子迅速萌发和生长,能形成大量的优质孢子,但不能引起菌种发生变异。所以,一般对孢子培养基的配制有以下几个要求:①营养不要太丰富(特别是有机氮源要低些),否则影响孢子的形成,如灰色链霉菌(链霉素产生菌)在葡萄糖一硝酸盐培养基上生长良好,并能形成丰富的孢子,但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白,就只长菌丝而不长孢子了。②无机盐的浓度要适量,浓度过高或者过低都将影响孢子的数量和质量。③要注意孢予培养基的pH值和湿度。④孢子培养基的组成要因菌种不同而异。工业生产中常用的孢子培养基有麸皮培养基,大(小)米培养基,用葡萄糖、无机盐、蛋白胨等配制成的琼脂斜面培养基等。上述培养基中的各种原材料的质量要稳定。(2)种子培养基种子培养基是供孢子萌发和菌体生长繁殖用的培养基,这种培养基能够使菌体长得粗壮,得到活力强的“种子”。所以种子培养基的营养成分要比较丰富与完整,同时其营养成分也应易被菌体吸收利用。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源,因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。无机氮源容易被利用,有利于菌体迅速生长,所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。其中氮源和维生素的含量应略高些,但总浓度以略稀薄为宜,这样可达到较高的溶解氧,供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分还要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的培养基pH值,其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。由于在发酵中种子质量对发酵水平的影响很大,为使培养的种子能较快地适应发酵罐内的环境,所以在设计种子培养基时一定要考虑与发酵培养基组成的内在联系,一般最后一级种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基,这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应周围环境,快速生长。(3)发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物用的培养基。一方面该培养基能使种子接种后迅速生长达到一定的菌丝浓度,另一方面又要使长好的菌体能迅速合成所需要的代谢产物。因此,发酵培养基的组成应丰富完整,除了具有菌体生长所必需的元素和化合物外,还要具有产物所需要的特定元素、前体和促进剂等,同时浓度要略高一些,以便微生物生长和繁殖。发酵培养基的组成还应考虑菌体在发酵过程中各种生化代谢之间的协调。例如,在产物合成期,为使发酵液中的pH值不出现大的波动,需要在适当的时候加入一些缓冲剂、生理酸性或碱性物质,以维持发酵液pH值的相对稳定。在发酵过程中,若因菌体生长和生物合成产物需要的总碳源、氮源、磷源等的浓度太高,或生长和合成两阶段所需的最佳条件不同时,还应考虑用分批补料的方式加以满足。最后在选用发酵培养基的原材料时,质量要相对稳定,不能影响产品的分离、精制和质量。三、培养基的选择不同微生物在培养过程中对培养基的要求是不同的,因此,不同微生物适宜的培养基也是不一样的。由此看来,在发酵生产中培养基的选择是非常关键的。在选择中一定要根据具体请况来确定:①对生产菌种的来源、生活习性、生理、生化特性和一般的营养需求进行深入地了解;②要搞清楚生产菌种的培养条件,生物合成的代谢途径;③需要知道代谢产物的化学性质、分子结构、提取方法。在上述工作都做好以后,从微生物营养要求的特点和生产工艺等出发,选择合适的培养基。这样既能满足微生物生长的需要,又能使发酵生产获得较高的产量和较好的生产效益。另外,在选择培养基时还要符合增产节约、因地制宜、发酵后不对环境造成污染的原则。下面我们将从几个方面详细介绍培养基的选择;1.培养基组分和配比的选择培养基的组分和配比对微生物的生长和产物的生成具有很大的影响。目前还很难做到从生化反应的基本原理推断和计算出适合某一菌种的培养基配方,基本上只能在生物化学、细胞生物学等基本理论的指导下,参照前人已经使用过的某一类菌种较适合的经验配方,再结合所用菌种和产品的特性,采用摇瓶、玻璃发酵罐等小型发酵设备,对碳源、氮源、无机盐和前体物质等培养基组分逐个进行单因子试验,从中了解这些因子对菌体生长和产物合成量的影响。最后再综合考虑各种因素,找到一个比较适合本菌种生产的培养基配方,以求得到高产。但在实际生产中,由于单因子试验需要消耗大量
本文标题:第三章中药发酵工艺条件
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