激光共聚焦显微镜的综述

激光扫描共聚焦显微镜的综述基本原理由于生物研究中免疫荧光技术的应用越来越广泛，研究人员发现，当实验室所用的荧光标本稍厚时，该显微照片的分辨率较低，由于传统显微镜技术都使用的是场光源，由于标本层次的重叠结构区别（内部细胞结构）就会产生衍射和散射光的干扰，使标本中的多处细胞结构的成像模糊和发散。激光共聚焦显微镜的首先主要是利用激光扫描形成的点光源，加上共聚焦原理，在荧光标记标本的焦平面上各个点的处理,光信号穿透探针小孔到达光电倍增管，再经过信号数字图像处理观察、分析和输出，在计算机监视屏上形成图像。其特点是可以对样品进行断层成像，非侵入的观察三维空间结构。由于光栅针孔和探针孔对物镜是共轭对称的，焦平面同时聚焦于光栅针孔和探测针孔。进行点扫描时，逐点扫描后才形成整个标本的光学切片。与聚焦光点相应的光源针孔和观察针孔必须对准，故称共聚焦。这样，大大提高了系统信噪比和成像清晰度。这种技术对于观察厚的样品显得尤为重要。传统的免疫荧光显微镜在厚的样品中只能看到表面发出的荧光，LSCM可以深入到样品内部，具体到某一个层面。20多年来，虽然共聚焦显微镜的扫描方式使得扫描共聚焦显微镜在生物医学领域有了广阔的用武之地。包括以下几个方面：⑴多波长激光器产生更明亮的点光源。⑵噪声很低光学检测器⑶效率很高的反射镜。⑷图像处理大大加快了。⑸视频显示技术分辨率大大提高。⑹亮度更大、更稳定的荧光探针激光共聚焦显微镜在生物医学中的应用1定量荧光测定LSCM通过计数接收到的光子，进行多次重复的荧光定量分析，和活细胞定量分析。LSCM通过这些方法来对单细胞或细胞群的各种细胞器，结构蛋白，核酸，酶和受体分子等特异性结构的含量与分布进行定量分析，同时还可测定膜电位，氧化还原状态等生化反应变化程度。此外，我们可以用LSCM来完成对细胞内的荧光强度、细胞周长及细胞内颗粒数等参数进行测定。我们还可以LSCM可用于细胞骨架装配、细胞凋亡机制、离子通道的装配等多个方面的研究。若我们利用LSCM技术，还可以甚至取代传统的核酸印迹杂交或者蛋白印迹杂交等技术,进行基因的表达检测,使得对所观察基因的转录和翻译等测量变得更加准确简单。荧光原位杂交技术（FISH）是进行基因定位和染色体分析的一项重要技术，它可以和LSCM结合发挥更大的作用。LSCM也可以对“生物芯片”上每个位点的荧光强度进行实时、灵敏、准确的检测和定量分析，目前主要应用在基因表达检测、和基因文库作图以及杂交测序等方面2定量共聚焦图像分析根据获得的细胞光学切片,可以测定细胞的物理、生物特性的变化,如核酸含量、分子扩散、胞内离子等。例如，我们可以根据LSCM产生的光学切片图像，分析正常及癌变细胞中细胞骨架与核之间的关系，对研究癌症的发展起到了关键作用。3三维重组分析生物结构LSCM通过薄层光学断层成像的功能,可获得荧光标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及重建三维图像，我们可以沿轴或任意角度来观察标本的横断面，还可以突出特征，生成整个结构体的三维效果。这让我们能更直观地进行形态学观察和空间关系。目前流行的三维重建技术可让我们获得特定结构200层甚至更多层面的横截面图像,确定复杂的内部联系,因此目前我们做实验时主要用于解释其三维结构与组织功能之间的关系。4动态观察生物结构，长时间观察细胞迁移和生长我们可以将激光扫描共聚焦显微镜设置成按定时和定方式两种方式进行激光扫描，实验时只需要很小的激光强度就可以完成传统很大的激光照射量，减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤。因此，由于每次损伤小，我们可以用LSCM于长时程定时扫描，记录细胞迁移等细胞生物学现象。传统方法对活体组织进行成像非常困难,成功的活细胞成像必须使细胞在成像过程里一直保持健康的生长状态,而传统方法较大的辐射量阻碍了细胞的成长。如果我们采用比较小的激光照射量（如LSCM）以减轻累积的光损伤，再加上在培养基中添加抗氧化剂,减少受激发的自由基带来的伤害，就可以完成对活体细胞的成像。我们利用合适的荧光探针,LSCM可对细胞内各种生命代谢所必须的离子如Ca2+,K+,Na+和pH等的动态变化作实时分析,甚至我们可以用LSCM完成生理信号如膜电位等的动态监测。例如，可以研究心肌细胞滑面内质网钙离子释放的机制。LSCM在胚胎学研究中也有广泛的应用。例如对卵子的活化和卵裂过程中的形态变化、对动物胚胎形成的形态学等进行研究。5荧光光漂白恢复(FRAP)技术若我们借助高强度激光照射细胞的某一区域,该区域周围的非淬灭（淬灭表明在荧光过程中，光子的数量在很短的时间内衰减或者消失。）分子会以一定速率向该照射的区域进行扩散,随后我们只需通过低强度激光扫描对检测此扩散速率，就可以由此揭示细胞结构和各种变化的机制。所以目前LCSM可用于研究细胞骨架、核膜结构和大分子传输等。在细胞生物学领域的主要应用有:研究生物膜脂质分子的扩散、通讯的研究；胞浆及细胞器内小分子物质转移的观测等。6质膜流动性测定我们将偏振光线激发细胞膜荧光探针后,会发现其发射光偏振的程度和荧光分子种类有关,而这种有序的运动又依赖于荧光分子周围的膜流动性。因此,通过计算机软件,LSCM可对膜的流动性进行必要的数据分析。这种膜流动性在测定在膜组成的分析、研究药物效应以及温度反应测定等方面有重要作用。7激光细胞显微外科及光钳技术LSCM可作“光刀”使用,由于其精细程度很高，我们可以对细胞膜完成瞬间穿孔、线粒体等细胞器的瞬间烧灼，染色体切割等细胞水平上的外科手术。同时，光钳技术,是利用学效应,用高能光束的力量将一个微米水平上的细胞器结构限制于激光束的焦平面,实现细胞微小颗粒和结构的移动、细胞融合技术及细胞骨架的弹性测量等，通过这种方法来无损伤地操纵生物粒子。LSCM与光刀、光钳的组合将有助于在分子水平,细胞水平研究生物医学:如染色体微切割、特定活体细胞生理状态检测、免疫细胞作用方式等。8光活化技术我们发现许多重要的生物活性物质和一些化合物(如神经递质、细胞内第二信使、核苷酸、某些荧光素等)可构成笼锁，将其功能进行封闭;一旦特定波长的光照射笼锁，则因活化而瞬间解锁，原有活性和功能得以恢复，正是基于这种特性，我们用他们在细胞增殖、分化等代谢过程中发挥重要作用。LSCM即具有光活化测定功能，可以产生使笼锁分解的合适的光波长和照射时间,从而人为控制多种生物活性产物，并控制其发挥作用的时间和空间。在生物医学上主要应用于:①肌肉生理,如胞内Ca2+对心肌钙电流的调控等;②钙和膜电位对神经递质释放的调节作用;③钙振荡的机制;④微管动力学。展望激光扫描共聚焦显微镜是目前研究细胞水平上应用非常广泛，同时分辨率很高的仪器，随着科学技术的发展，激光扫描共聚焦显微镜会朝着更灵敏，微型和便于运用的目标发展，例如现在多家公司正在研制多光子LSCM，多光子技术就是使一个荧光分子同时吸收两个及以上光子的技术。由此就可以利用低能光子同时释放能量来代替单个高能光子的作用。总体上来说，激光扫描共聚焦显微技术的发展趋势有两大个，其一是从光学物理工作原理上进一步的革新，来提高其诊断和观察效率，使之成为更长时间记录的高分辨率显微仪器；另一方面是与多光子技术相结合,提高激光束的穿透能力，降低光对细胞带来的损伤。目前，多光子显微技术仍处于萌芽发展阶段，主要优点是细胞光毒性较小，因而可延长观察时间，同时穿透性较好，理论上的最大穿透深度可达200～500μm，能够观察更厚的标本，主要问题是分辨率比激光扫描共聚焦显微镜低，价格十分昂贵。因此,在未来的几年内，高质量的激光扫描共聚焦显微镜仍然是生物医学研究中最有效和最有使用价值的主要研究仪器之一。参考文献：1.激光扫描共聚焦显微技术.李楠等著.北京:人民军医出版社2.激光扫描共聚焦光谱成像系统张运海;杨皓旻;光学精密工程期刊3.激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用陈耀文;林珏龙;激光生物学报4.激光扫描共聚焦显微镜图像分析与三维重建唐郭强华中科技大学