燕山大学-本科毕业设计(论文)开题报告

燕山大学本科毕业设计（论文）开题报告课题名称：产莽草酸工程菌的底盘构建与路径优化学院（系）：环境与化学工程学院年级专业：11级生物工程学生姓名：指导教师：完成日期：2015.3.23一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义莽草酸是芳香族氨基酸合成途径中重要的中间体，该途径广泛存在于微生物和植物中，终产物为L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸等芳香族氨基酸[1]。它具有众多生理功能：通过影响花生四烯酸代谢来抑制血小板聚集，从而可以抑制动、静脉血栓及脑血栓形成；具有抗炎、镇痛作用；还可作为抗病毒和抗癌药物的中间体。此外，莽草酸是可以抑制禽流感病毒的药物——达菲的重要原料[2]，随着禽流感疫情在全球蔓延，莽草酸越来越受到人们的关注，需求逐年递增。近年来，对莽草酸的生产研究取得了较大的进展，提取方面范围从八角、松针等不断扩大，提取方法从简单的溶剂提取，发展到采用超临界二氧化碳脱脂，釆用微滤、超滤、纳滤，使用离子交换树脂，使用大孔吸附树脂，使用硅胶层析，使用微波辅助提取等一系列方法，对莽草酸进行提取纯化[3]。随着禽流感的流行，为了突破提取法生产莽草酸受八角成熟时间、生长周期、生长地域和产量等的影响[4]，利用生物技术合成莽草酸成为研究的热点，诱变选育莽草酸高产菌株和构建基因工程菌成为最主要的手段，均有国内外专利涉及。另外，对莽草酸及其衍生物的合成及药理研究也逐步深入。目前，国外关于莽草酸的生物合成研究主要集中在密歇根大学，Chandran等[5]通过对大肠杆菌中心代谢途径以及莽草酸途径的代谢调控，莽草酸含量达到84g∙L-1；ShiraiM等[6]通过诱变筛选，获得一株莽草酸产量为10.42g∙L-1的柠檬酸杆菌；Iomantas等[7]将aroA(G)，aroD质粒导入aroI缺失的枯草杆菌，莽草酸含量为19.7g∙L-1；AlbertoRodriguez等[8]剔除大肠杆菌PTS和pykF基因，莽草酸含量为43g∙L-1。国内，付小花[9]用Red重组系统敲除了E.coliTop10F的aroL基因，莽草酸产量为22.07g∙L-1，是原始菌的1.57倍；汪莉等[10]利用Red重组系统敲除了E.coliDH5α的aroK和aroL基因，构建了包含莽草酸代谢途径限速酶PtacaroEaroFaroBkan多基因盒的载体，将多基因盒替代shiA基因，莽草酸产量为8.3g∙L-1，葡萄糖转化率为40%。陈献忠等[11]基于野生型大肠杆菌B0013利用葡萄糖或木糖作为碳源可快速增长的能力，通过系统代谢工程，合理设计结合扩大流程，莽草酸产量为15g∙L-1。选题依据：莽草酸是大抗禽流感药物“达菲”合成的关键手性起始原料[2]，需求逐年增加。大肠杆菌具有遗传背景清楚、生长速度快、发酵周期短以及易于分子操作等优势，是代谢工程育种中最常用的宿主[12]。通过前人的实验研究，通过重组大肠杆菌生产莽草酸的一套体系已经初步建立，而完整、成熟的利用重组大肠杆菌生产莽草酸的体系还需要进一步研究。研究意义：莽草酸作为重要的原料物质，市场需求庞大，具有很大的商业价值。但是国内现有的生产方式由于步骤冗长，成本高，得率低不能满足市场的需求。利用廉价的原料如葡萄糖和微生物的莽草酸代谢途径发酵生产莽草酸是解决市场需求的有效途径[13]。国外已有较多的莽草酸生物合成方面的研究报导，而我国从事这方面研究比较少，通过本课题的开展希望能为构建高产莽草酸基因工程菌奠定基础。二、研究的基本内容，拟解决的主要问题研究的基本内容：本实验共分为三部分。第一部分为：根据细胞代谢网络分析，利用Red重组系统[14]删除E.coliDH1的莽草酸激酶基因(aroL和aroK)、丙酮酸激酶基因(pykF和pykA)、葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的关键组分EIICBglc的编码基因(ptsG)以及PEP羧化酶编码基因(ppc)，以构建产莽草酸的底盘菌。第二部分为构建表达载体pSA1。第三部分为将重组质粒转化到大肠杆菌突变株内，出发菌和系列突变株进行发酵培养，通过比较代谢工程菌的细胞生长、底物利用性能以及莽草酸的合成能力，得出最佳产莽草酸大肠杆菌工程菌。拟解决的主要问题：构建产莽草酸大肠杆菌工程菌，提高莽草酸的产率。三、研究步骤、方法及措施1.产莽草酸工程菌的底盘构建(1)将46FLP质粒用电转化方法转化到大肠杆菌DH1中，涂板挑取单菌落培养。(2)用相应的敲除引物，以pKD13为模板，进行PCR扩增，将PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳回收；(3)用电转化或化学转化方法将目的片段转化到大肠杆菌感受态细胞，35℃250rpm，摇床培养3h。(4)无菌条件下，取适量菌液加到含卡那抗性的LB固体培养基平板上，用无菌的玻璃珠将细胞均匀涂开。37℃培养12-16h。(5)经菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳，验证是否敲除成功。(6)将获得的菌株于含四环素的培养基中过夜培养，然后将菌液分别涂于含氨苄抗性和卡那抗性的培养基中，对卡那抗生素敏感的克隆即为所需菌落。2.产莽草酸路径优化—构建表达载体pSA1将tktA、aroG、aroB、aroD和aroE基因依次连接与载体连接，构建表达载体pSA1。3.底盘菌与优化路径的适配组合(1)重组质粒通过电转化法或化转法转化到大肠杆菌突变株内，系列突变株进行35℃、250rpm摇床培养（电转化培养3h，化转法培养45min）。(2)用菌落PCR法验证重组菌。(3)将大肠杆菌原始菌和系列突变菌于LB液体培养基中，37℃，200rpm摇瓶培养9h作为种子液。(4)用种子液收集适量菌体，以发酵培养基重悬后在37℃，200rpm摇瓶培养。(5)每隔2h取样测OD600，确定菌株生长情况。(6)用生物传感仪测量发酵液中葡萄糖残留量，从而确定菌体消耗葡萄糖的情况。(7)莽草酸的提取：将菌液离心，取上清，用尼龙膜过滤收集。(8)莽草酸浓度用高效液相色谱分析[15]。四、研究工作进度第1周-第4周：确定论文题目，撰写开题报告。第5周-第8周：构建产莽草酸底盘菌；第9周-第12周：优化莽草酸生产路径及底盘菌与优化路径的适配组合。第13周-第16周：整理实验数据，完成毕业论文。第17周：论文答辩五、主要参考文献[1]陈凯,滕再进,周长林.利用重组大肠杆菌合成莽草酸的研究进展[J].药物生物技术,2012,9(5):466-470.[2]李明明,陈献忠,周丽.理性设计和构建过量合成莽草酸的大肠杆菌代谢工程菌[J].生物工程学报,2013,29(1):56-57.[3]谢济运.莽草酸的提取及分析研究进展[J].畜牧与饲料科学,2011,32(3):70-73.[4]汪华,崔志峰.莽草酸生物合成途径的控制[J].生物技术通报,2009(3):50-53.[5]ChandranSS,YiJDrathsKM,VonDaenikenR,etal.Phosphoenol-pyruvateavailabilityandthebiosynthesisofshikimicacid[J].BiotechnolProg.2003,19:808-814.[6]ShiraiM,MiyataR,SasakiS,etaL.MicroorganismbelongingtothegenusCitro-bacterandprocessforproducingshikimicacid[P].EuropeanPatent:1092766.2001.[7]IomantasY,AbalakinaEG,PolanuerB,etal.Methodforproducingshikimicacid[P].USPatent:6436664.2002.[8]AlbertoRodriguez,JuanAMartínez,JoséLBáez-Viveros,etal.Constitutiveexpressionofselectedgenesfromthepentosephosphateandaromaticpathwaysincreasestheshikimicacidyieldinhigh-glucosebatchculturesofanEscherichiacolistrainlackingPTSandpykF[J].MicrobialCellFactories,2013,12:86-96.[9]付小花.莽草酸基因工程菌构建的初步研究[D]:[硕士学位论文].上海:复旦大学,2007,12-19.[10]汪莉.一种利用生物合成技术制备莽草酸的方法及所使用的工程菌[P].中国专利,200710110469.2007-12-12.[11]XianzhongChen,MingmingLi,LiZhou,etal.MetabolicengineeringofEscherichiacoliforimprovingshikimatesynthesisfromglucose[J].BioresourceTechnology,2014,166:64-71.[12]陶海明.大肠杆菌工程菌发酵生产莽草酸的工艺研究[D]:[硕士学位论文].杭州:浙江大学,2014,3-10.[13]周涛,周敏,王晓平.莽草酸的研究新进展[J].中外健康文摘,2009,6(19):230-231.[14]ChanwooSong,SangYupLee.Rapidone-stepinactivationofsingleormultiplegenesinEscherichiacoli[J].BiotechnologyJournal,2013,8:776-784.[15]白朝辉,石晓峰,刘东彦等.莽草酸含量测定研究进展[J].中药与临床,2013,4(5):61-64.六、指导教师意见……………………………………………………………………………………………指导教师签字：年月日七、系级教学单位审核意见：审查结果：□通过□完善后通过□未通过负责人签字：年月日