猪流性腹泻腹泻病毒的假病毒相关研究

前言猪流行性腹泻假病毒的研究摘要猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒属，冠状病毒科，能够导致仔猪严重腹泻，给养猪业带来重大的经济损失。S蛋白作为PEDV最主要的膜蛋白，已有报道证实S蛋白含有病毒感染细胞的抗原表位区，但关于S蛋白介导PEDV进入细胞还有待于进一步研究，故本主要通过构建PEDVS1的伪型病毒研究富含抗原表位区的S1蛋白在PEDV进入细胞中的作用。本研究中，首先，为有效的检测PEDV，利用VeroE6繁殖的PEDV做为抗原，制备PEDV全病毒多克隆抗体。利用ELISA和间接免疫荧光对抗体的效价和特异性进行检测，结果显示该多克隆抗体与PEDV有很好的特异性反应。其次，为研究PEDV的感染特性，摒弃非同源细胞系，对PEDV在猪小肠上皮细胞（IEC）上进行适应培养，通过在IEC细胞中盲传10代，对第10代病毒液进行检测。反转录PCR、间接免疫荧光和电镜检查均证实PEDV能够感染IEC细胞系，并稳定传代，故最终确定IEC是PEDV的易感细胞系。再次，为研究PEDVS1蛋白功能，构建S1蛋白的真核表达质粒，建立稳定表达S1蛋白的BHK-21细胞系，命名为BHK-S1。反转录PCR和间接免疫荧光鉴定，成功构建了BHK-S1稳定细胞系。利用BHK-S1稳定细胞系和重组的VSV系统，成功制备PEDV的伪型病毒VSVΔG*S1。反转录PCR和激光共聚焦检测结果显示，重组病毒构建成功。最后，为研究S1蛋白在VSVΔG*S1感染IEC细胞中的作用，对感染VSVΔG*S1的IEC细胞中的S1蛋白进行动态定位。激光共聚焦结果显示，S1蛋白在病毒感染IEC细胞系的吸附和进入过程中发挥关键作用。本研究为进一步检测PEDV提供了有效实用的实验材料，为研究PEDV的感染特性和探索S1蛋白在PEDV感染细胞时的作用提供了参考。关键词：猪流行性腹泻病毒；易感细胞系；稳定表达系；假病毒；感染特性1猪流行性腹泻病毒1.1PEDV的根源猪流行性腹泻病毒（PEDV）从属于冠状病毒科，冠状病毒属，是单链，有包膜的RNA病毒，与其他冠状病毒类似，其病毒粒子形态呈多形性，大多数类似球形，大小平均为130nm，外有囊膜，纤突呈花瓣状，纤突大小介于18-23nm，呈放射分布，病毒粒子的中央称为电子不透明区。然而，人们对于病毒内部的了解甚少。在欧洲，青年种猪，育肥猪和架子猪主要被猪流行性腹泻病毒感染。而在我国，猪流行性腹泻病毒感染多个年龄的猪群[1]。冬季，由于猪流行性腹泻病毒引起的病毒性腹泻，母猪以及哺乳仔猪感染该病毒几率较低于育肥猪和保育猪群[2]。该腹泻病毒引起的腹泻病的临床症状大都表现为感染猪食欲废绝或者减退，精神不振，眼窝下陷，明显的全身脱水，水样腹泻，伴有呕吐，其粪便稀少，颜色呈灰黄色或者黄色，腹泻时间3-4天后，病猪将会由于脱水过重而死亡。猪前言流行性腹泻与猪传染性胃肠炎(TGE)的临床症状较为相似。二者相比，前者传播较慢，但持续时间较长，腹泻的程度与后者相比也较轻[3]。于1971年，猪流行性腹泻首次在英国发现[4]。由Debouck等成功分离得到猪流行性腹泻病毒则在1978年，将之定名CV777。随后关于该病毒在多个国家被相继报道[6]，尤其在美国、韩国和朝鲜等。因为该病毒将近传遍欧洲，有学者将该病叫做“流行性病毒性腹泻(EVD)”，于1976年，首次报道了与猪传染性胃肠炎相似的，可以危害哺乳仔猪的急性腹泻。人们为了排除已知的肠道致病性病原以及猪传染性胃肠炎病毒，故将该病亦称为“EVDII型”，为了和早期发现的”EVD型I”分开。直至20世纪的80年代初，各国学者证实此两种引起病毒性腹泻的病原都是同一种冠状病毒，此后，一致命名为“猪流行性腹泻(PED)”[5]。1.2PED流行病学自1978年在比利时首次分离得到PEDV后，从20世纪的80年代到90年代，该病在欧洲大面积爆发，包括荷兰、英国以及瑞士等。然而，在亚洲的爆发更为严重，中国、泰国、韩国以及日本尤为明显。随后，于2012年，该病在美国多个州盛行，包括科罗拉多州、爱荷华州和明尼苏达州等。大部分的爆发集中在10日龄的仔猪，日前，PED仍在世界范围内呈大面积流行，给各地养猪业带来不同程度的损失。1.3PEDV基因结构PEDV结构为有包膜，单股正链的线性RNA病毒，与其他冠状病毒成员相似。基因组全长26950~32950nt，5’端含有一个帽子结构（cap），3’端含有一个Poly（A）尾巴，且其3’端和3’端分别包含一个非翻译区（5’UTR和3’UTR）。目前已发现的7个开放阅读框从5’端到3’端的顺序依次为：ORFla（11000~13000nt）、ORFlb（8000~9000nt）、S基因（4100~4250nt）、ORF3基因（650~720nt）、M基因（660~730nt）、E基因（220~245nt）、N基因（1260~1450nt），其中共编码四个结构蛋白，分别为纤突蛋白（S基因）、小膜蛋白（E基因）、膜糖蛋白（M基因）、核衣壳蛋白（N基因），和三个非结构蛋白，分别为复制酶多聚蛋白1a/1b和ORF3蛋白。复制酶多聚蛋白基因由两大开放阅读框构成（ORF1a和ORF1b），占5’端，覆盖近全长的三分之二，位于编码四种主要结构蛋白的基因上游。1.4PEDV主要结构蛋白功能PEDV的主要结构蛋白有四种，分别是纤突蛋白（S蛋白）、膜糖蛋白（M蛋白）、核衣壳蛋白（N蛋白）、小膜蛋白（E蛋白）。S蛋白是一种存在于病毒粒子表面、组成病毒囊膜的重要结构蛋白，分子质量150~220kDa，由1383个氨基酸构成，包含多个糖基化位点，属于I型糖蛋白[7、18]。冠状病毒的S蛋白大都具有相近的功能和结构特点，根据其保守序列的相似性，PEDV的S蛋白被分为两个结构域：S1区（1~789aa）和S2（790~1383aa）前言[14]。有研究者将S1区人为的划分成两个区域：第一个区域为N端的250个氨基酸残基；其余部分为第二个区域，其中有90个残基，因与其他冠状病毒相比具有较大的差异性，被认为极有可能成为PEDV的特异性抗原决定簇[7、10-12]。S蛋白能够调节细胞表面受体与病毒粒子的结合，从而在病毒入侵中发挥关键作用，同时在刺激宿主免疫介导产生中和抗体过程中扮演重要角色[12-15]。在2005年，有研究者将S蛋白的中和表位以无烟碱烟草植物为载体进行表达，并用表达产物免疫仔猪，结果证实获得的高效表达的蛋白具有较好的免疫原性。2006年孙东波[9]等利用fd丝状噬菌体展示技术研究分析了PEDVS蛋白抗原表位的免疫优势区，结果得出三个抗原表位区：S1P1（248～280aa）、S1P2（442～499aa）和S1P3（697～742aa），该研究结果为PED诊断方法的建立以及开发新疫苗提供了新的思路和理论依据。M蛋白大量存在PEDV囊膜中，是装配病毒粒子时所必须的重要结构蛋白，是由226个氨基酸组成的多肽，分子质量约为20~31kDa。M蛋白为跨膜蛋白，由三个结构域组成：位于膜内的大的C末端、位于膜外的短小糖基化N末端及α螺旋区。M蛋白也在免疫介导过程中发挥重要作用，能够刺激机体产生α-干扰素及中和病毒粒子的抗体[16-18]。当补体存在时，抗M蛋白囊膜外抗原表位的单克隆抗体具有良好的抑制病毒感染的能力[19]。N蛋白与病毒RNA相互缠绕，是病毒核衣壳的重要成分。由441个氨基酸组成，分子质量为58kDa左右。在猪感染PEDV的早期，就有大量的抗N蛋白抗体产生，同时编码N蛋白的序列高度保守，使得N蛋白拥有良好的免疫原性，因此N蛋白是用作PEDV早期精确诊断的理想靶蛋白。E蛋白是最小的结构蛋白，位于病毒囊膜上。由76个氨基酸构成，分子质量仅约8kDa。目前针对E蛋白的研究表明，E蛋白对于包膜形成、病毒的形状形成、出芽过程、病毒复制、以及诱导细胞凋亡有决定性作用[20]。1.5PEDV非结构蛋白功能复制酶多聚蛋白1a/1b是分别由开放阅读框ORF1a和开放阅读框ORF1b编码的非结构蛋白，大小约753.06kDa（复制酶多聚蛋白1a约452.82kDa，复制酶多聚蛋白1b约300.24kDa）。目前已证实，在PEDV入侵宿主细胞的过程中，复制酶多聚蛋白1a/1b在入侵早期能够发挥重要作用[21]。开放阅读框ORF3编码的ORF3蛋白是一种与膜糖蛋白（M蛋白）相近的非结构蛋白，位于病毒包膜的小膜蛋白（E蛋白）与纤突蛋白（S蛋白）间隙中，分子质量约25.5kDa，尾部含有六个His。ORF3蛋白是PEDV的辅助蛋白，被认为能够对病毒的毒力产生较大的影响，可被用作分子标记来判断病毒毒力衰减以及对细胞培养的适应性[22-23]。ORF3基因具有多态性，存在至少3个可变区，还包括核苷酸的一段短缺失（2~7bp），所以ORF3蛋白的生物学意义仍有待于进一步的研究。1.6PEDV细胞表面受体研究进展哺乳动物的氨肽酶N（aminopeptidaseN，APN，CD13）是一种Ⅱ型细胞表面金属蛋白酶，其外部结构域糖基化程度较高，而且活性部位有一个锌离子[24]。前言目前，APN被认为是几种Ⅰ群冠状病毒的细胞表面受体，包括猪传染性胃肠炎病毒、人类冠状病毒229E和猫冠状病毒[25-27]，而关于猪氨肽酶N（porcineaminopeptidaseN，pAPN）是否参与PEDV感染过程的研究较少。OhJS等[28]在2003年证实，兔源抗pAPN多克隆抗体能够抑制PEDV与pAPN蛋白的结合，并且，用可溶性pAPN蛋白预处理的VeroE6细胞培养病毒可以增强病毒的感染力。pAPN是一种大小约150kDa的糖基化蛋白，大量存在于小肠黏膜上[28-29]。LiBX等[30]于2007年证明，表达pAPN的MDCK细胞（一种犬肾细胞系）更容易被PEDV感染，同时感染可以被抗pAPN多克隆抗体所抑制。NamE等[31]人培养了能够稳定表达pAPN的ST细胞，并在之后的PEDV细胞感染实验中证明，pAPN的过表达有助于病毒在ST细胞中的复制。尽管PEDV能够在不表达pAPN的猴源细胞系VeroE6细胞上连续传代，但数据明确显示pAPN与PEDV感染之间有关联[32]。1.7PEDV繁殖与装配PEDV作为冠状病毒的一种，是最大的RNA病毒，其繁殖装配过程机制较为复杂，包含有多种病毒及细胞蛋白的参与。PEDV基因组的第一个开放阅读框编码一个较大的多聚蛋白，即复制酶多聚蛋白1a/1b，后期被加工成一系列直接或间接与病毒复制相关的病毒蛋白，包括RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）、RNA解旋酶、蛋白酶、金属结合蛋白和一些功能未知的蛋白。基因学水平的研究认为这其中的大部分蛋白都参与了RNA病毒的复制。除了病毒蛋白之外，很多细胞蛋白也被认定与PEDV复制顺式作用元件相互作用，如异质核糖核蛋白（hnRNP）A1、PTB、PABP和线粒体顺乌头酸酶等。与其他RNA病毒相似，PEDV能够将细胞RNA转录翻译体系的细胞蛋白改变，从而被病毒复制所利用。尽管目前关于PEDV的RNA复制机制尚有争议，但学者们普遍认同：其RNA复制是由病毒RNA上的顺式作用元件指导，配合其编码的反式作用因子共同完成。事实上，连续的蛋白质合成依赖于RNA的合成，因为蛋白合成的抑制因子能够在病毒复制周期的任一阶段来抑制病毒RNA的合成[33-34]。参与复制的这些蛋白产物的具体精确的性质和功能删除有待于进一步发掘。PEDV的复制不仅有病毒蛋白的参与，还包含了很多细胞蛋白，这些细胞蛋白在PEDV的作用下不再行使其在宿主细胞中的正常功能，转而在病毒复制周期中扮演重要角色。在感染细胞提取物中没有能够与病毒RNA发生交联反应的病毒蛋白，这说明病毒蛋白与病毒RNA之间的相互作用只是通过细胞蛋白间接发挥作用。2假病毒2.1假病毒的发展假病毒研究起始于逆转录病毒载体的应用，是伴随着重组病毒表达技术、哺乳动物细胞蛋白表达技术的提高而发展起来的[35]。从最初的重组痘病毒感染哺乳动物细胞生产系统经历重组塞姆利基森林病毒(SFV)系统到酵母表达系统，以及最新的哺乳动物细胞转染表达系统。用哺