猪淋巴细胞转化实验

猪淋巴细胞转化实验1.采集抗凝血每个10ml注射器吸入100ul肝素钠抗凝剂（20mg/ml），每个样品无菌采血5-8ml。（保存在4°环境，从猪场回来最好放在冰盒中）2、淋巴细胞分离，采集的肝素抗凝外周血液（肝素用量20U/mL），可采用以下方法进行分离。（1）Ficoll-Comray（聚蔗糖——泛影钠）分离淋巴细胞法：用10毫升的试管，加入4毫升淋巴细胞分离液（比重介于1.0-1.090之间），在这种分层液的界面上，轻轻加入4毫升左右肝素化的血液，千万不要打乱两液间的液面。然后用1500rpm，离心15分钟。此时即可见到液体分为四层。最下层是红细胞和粒细胞，分层液在它的上层，最上层是血浆层。淋巴细胞在血浆层和分层液之间，淋巴细胞多时，可呈现一层乳白层。用移液器直接插入淋巴细胞分层液吸取淋巴细胞1.5mlEP管中，充分混匀，2000rpm离心10分钟，弃去上清，即获得纯淋巴细胞，可加入适量HanK’S液进行计数，应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。（2）红细胞裂解法用10毫升的试管加入8ml的Tris-MH4C1红细胞裂解液，然后加入2-4ml抗凝血，室温放置20min（每各5min上下缓慢摇匀一次），后1500rpm离心10min，弃掉上清，用HanK’S液混悬细胞进行计数（如果红细胞很多，可以再用5ml裂解液裂解一次）。应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。3.流式细胞仪检测CD3/CD4/CD8步骤待血液样品和灌注液样品都计数完毕后，吸取一定体积含有106的细胞悬液，1500rmp离心3min，弃掉上清液，加入用PBS混匀的含有CD3/CD4/CD8混合抗体的反应液80ul，混匀后4℃反应30min。待反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入0.5ml含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。加入0.5ml含有4%多聚甲醛的PBS，4℃反应30min。反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入0.5ml含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。再用不含胎牛血清的PBS液洗涤一次，最后用200ulPBS液重悬细胞进行上机检测。（最多4℃放置过夜）4.MTT实验步骤1）接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔100000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul.2:培养细胞：每个样品设置10个重复孔，其中5个孔加入10ulConA(孔中终浓度5ug/ml),另外5个孔加入10ul培养液，同一般培养条件，培养68h，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBSph=7.4配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，1500rpm离心10min，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150ulDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。无钙、镁的Hank’s配方：8g/LNaCl,0.4g/LKCl,1g/L葡萄糖，60mg/LKH2PO4,47.5mg/LNa2HPO4,调pH至7.2。