浙江大学-刘振伟教授高级培训班-膜片钳技术数据处理与分析ppt

Clampfit10膜片钳实验数据的处理与分析2014年4月23-25日杭州浙江大学膜片钳技术高级培训班刘振伟一、膜片钳实验数据的处理二、全细胞记录数据的分析三、单通道记录数据的分析四、突触放电活动数据的分析2PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014内容3PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理一、基线的调零二、坏点的去除三、滤波四、数据文件内部/之间的数学运算4PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理一、基线的调零基线的确认全细胞记录基线易确认，单通道记录基线不易确认。•单通道开放时间较长•所记录的时间较短•同时开放的通道数目较多且长时间持续开放确定通道电流的方向：电流方向向上，最负向是基线位置，反之亦然。如何确定：膜片两侧液体、钳制电位单通道电流基线的确认如果通道开放时电流向上，则基线在最下面的位置基线通道开放5PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理6PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理基线不在零点的原因封接电阻的改变：漏电流失调电位的存在：偏移、漂移噪声的干扰：交流干扰高通滤波的影响：对记录线的起始部位产生影响7PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理基线调零方法打开Analyze/Adjust/Baseline（1）Subtractmeanof（去除均值法）：适用于去除直流偏移。（2）Subtractslopeof（去除斜率法）：适合于去除持续线性漂移。（3）Subtractfixedvalue（去除固定值法）：适用于去除直流偏移。数值有正负之分。（4）Adjustmanually（手工调零法）：适合于单通道电流的基线或基线漂移无规律。8PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理坐标零点坐标零点EpochA段（1）Subtractmeanof（去除均值法）（2）Subtractslopeof（去除斜率法）9PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理（3）Subtractfixedvalue（去除固定值法）（4）Adjustmanually（手工调零法）10PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理基线调零的注意事项（1）有些只相对值（如电流幅度的变化值），不需要将基线调零。但多数情况需要基线调零，建议都要进行基线调零。（2）对于基线变动复杂的数据，基线调零可能会用到上述的几种方法。（3）对于某些基线变动，Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。建议最好在采集数据时就设法调整好基线。11PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理Clampfit演示基线调零方法12PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014二、坏点的去除坏点产生的原因刺激伪迹：给标本施加刺激时产生。电容瞬变电流：电容的充放电反应。瞬时脉冲干扰（Glitch）：打开电源开关（日光灯、仪器设备开启时）手机来电：一过性高频。人手靠近记录探头：高幅、高频。膜片钳实验数据的处理13PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014坏点的赋值（1）Datavalueatcursor1：Cursor1的数值。（2）Meanbetweencursor1..2：Cursor1-2之间均值。（3）Meanbetweencursor3..4：Cursor3-4之间均值。（4）Straight-linefitbetweencursor1..2：Cursor1-2之间的直线拟合值。（5）Fixedvalue(pA/mV)：输入一个固定的数值。膜片钳实验数据的处理14PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理Clampfit演示去除坏点15PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014注意事项（1）坏点太多时，应在记录前予以去除。（2）坏点持续时间短，如果出现持续时间较长的坏点，则数据要废弃。膜片钳实验数据的处理16PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014三、滤波信号采集前的滤波全细胞通道电流记录：1-2kHz全细胞突触活动记录：10kHz单通道电流记录：10kHz动作电位记录：10kHz膜片钳实验数据的处理17PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014信号采集后的滤波膜片钳实验数据的处理18PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014LowpassHighpassBandpassNotchElectricalInterferenceClampfit滤波类型膜片钳实验数据的处理19PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014Lowpass最为常用。Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示在该框底部。7种类型：（1）8-poleBessel：数据失真小，普遍用于时域数据。（2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前后一些数据点（取决于Smoothingpoints，取3-99中的奇数）的平均值赋予当前数据点，完成滤波。Smoothingpoints值越大，数据幅度削减越大。（3）Gaussian：数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均值中所占的比例较大。（4）RC(8-coincident-pole)：用于时域数据。（5）RC(single-pole)：用于时域数据。（6）8-poleButterworth：用于频域数据。（7）8-poleChebyshev：用于频域数据。膜片钳实验数据的处理20PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理Clampfit演示Lowpass滤波21PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014Highpass又称交流耦合（ACCoupling），可削弱低频信号而通过高频信号。Clampfit提供两种：8-poleBessel，单极RC采用-f-3dB，Clampfit自动计算出f-3dB范围并显示在该框底部。最常见的是在神经元上进行细胞内记录时使用高通滤波器，它可降低膜电位的低频振荡对突触电流的干扰。膜片钳实验数据的处理22PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理Clampfit演示Highpass滤波23PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014Bandpass相当于低通滤波与高通滤波的交叉，需要同时设定高通滤波与低通滤波。高通滤波的f-3dB不能高于低通滤波的f-3dB。带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时，对其它频率的噪声进行滤波。膜片钳实验数据的处理24PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014Notch带阻滤波：削弱某一特定频率（如50Hz交流）信号。中心频率（Centerfrequency）：10-3,000Hz。频率宽度（–3dBwidth）：频率宽度。-3dBwidth越窄，滤波需要的数据点越多，滤波效果越好。膜片钳实验数据的处理图.Notch滤波器的幅度响应曲线Centerfrequency:60Hz;–3dBwidth:10Hz–3dBwidthCenterfrequency25PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理Clampfit演示Notch滤波26PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014ElectricalInterference（EI）电干扰滤波器（Electricalinterferencefilter,EI）为数码滤波器。可同时去除50Hz及其谐波（100Hz、150Hz等）的复杂交流噪声。Harmonicsfrom1to：用于设定欲去除的交流谐波的最高数目，最大数目为20（对应于1kHz），一般去除第1-3个就够了。Cyclestoaverage：数目越大，-3dB频率宽度越窄，滤波效果越好，但需时越长。Referencefrequency：选50Hz。膜片钳实验数据的处理27PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014EI所需最少数据点的计算举例滤波器所需最少数据点＝（采样频率/50Hz）×Cyclestoaverage若采样频率＝10kHz，则一个50Hz正弦波周期的采样点数＝10kHz/50＝200点若设定Cyclestoaverage＝10，则需要的最少采样点数＝2,000点采样数据点不够的话，将不能清除谐波干扰。膜片钳实验数据的处理28PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014四、数据文件内部/之间的数学运算Analyze/AverageTraces平均文件内任意几条相同的Trace，获得平均后的一条Trace。要求：Clampex软件的Fixed-lengthevents、Episodicstimulation和High-speedoscilloscope模式。重复记录的信号，时程必须固定不变。膜片钳实验数据的处理29PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014降低信号噪声信号频率谱与噪声频率谱一致或有重叠时，滤波不行。平均Trace的原理：设有N条Trace，则（见表）：•先累加所有N条Trace，此时信号幅度增大为原来的N倍，而噪声却只增大为原来的√N倍。•然后再除以Trace条数N，信号幅度不发生大的变化，而噪声幅度却降低为原来的1/√N。膜片钳实验数据的处理30PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理Clampfit演示AverageTraces功能31PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014Analyze/SegmentedAverage可对几个Trace中的某一相同时段（如EpochA）或Cursor1-2之间的时间段进行平均，平均后的文件通常用于Analyze/SubtractControl功能中的ControlFile。膜片钳实验数据的处理32PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014Analyze/Arithmetic对文件内的任何Trace进行加减乘除等运算，使原来的Trace得到新值。如t3=t1+t2，t3=2t1+3t2Results窗口中的该功能可对不同Column的数据进行运算，得到新的Column的数值。膜片钳实验数据的处理33PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014Analyze/AverageFiles对几个文件进行平均。例如在进行相同的实验时，需要将几个采样文件相应的每一个Trace进行平均。平均后的文件会自动生成，文件名为Average000-999.abf。仅适用于EpisodicStimulation、High-speedoscilloscope模式的数据；Protocol设置必须一致。同样具有降低噪声的作用。膜片钳实验数据的处理34Pat