离心实验方案

离心实验报告（方案）（分离并鉴定叶绿体和线粒体、细胞核）一、实验仪器剪刀、研钵、三角瓶、小烧杯、纱布、超声波细胞破碎仪、玻棒、离心管、注射器、离心管架、普通高速离心机、超速离心机、载玻片、盖玻片、胶头滴管、接种环、镊子、擦镜纸、吸水纸、冰箱、数码显微镜二、实验药品液氮、50mmol/LTirs-盐酸缓冲液（PH=7.4）、0.25mol/L蔗糖溶液、詹纳斯绿染液（线粒体）、姬姆萨染液（细胞核）、香柏油（人工）、二甲苯三、实验材料蒌蒿鲜茎叶、根四、实验原理将破碎后的细胞进行离心实验，设置不同转速梯度，从而得到不同转速下的沉淀，收集沉淀用数码显微镜进行观察，看是否分离得到线粒体和叶绿体。五、溶液配制1、缓冲液的配制：50mmol/LTirs-盐酸缓冲液配法（PH=7.4）：50ml0.1mol/LTris溶液溶于42ml0.1mol/L的盐酸，混匀加水稀释至100ml0.1mol/LTris：12.114g溶于1L水，0.1mol/L盐酸：1ml36%HCL定容与100ml水中2、0.25mol/L蔗糖溶液（悬浮介质）：8.56g溶于100ml水中注：蔗糖等一些小分子溶液，可以预先在分离的样品中形成密度梯度，在上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。然后0.25mol/L的蔗糖形成的密度梯度的最大值比叶绿体匀浆介质密度要小，满足密度梯度离心的要求低温下研磨一般都是保护作用，防止蛋白质变性3、1%詹纳斯绿染液：称取50mg(pH7.4)，詹纳斯绿B溶于5ml生理盐水中，稍微加热使之溶解后，过滤，即为1%原液4姬姆萨染液(Giemsa)：称取姬姆萨粉0.5g，甘油33ml、纯甲醇33ml。先在姬姆萨粉中添加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2h使其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。使用时吸出少量，用1/5mol/L磷酸缓冲液作10~20倍稀释。六、实验步骤：1、样品采集：采集菊科蒿属植物蒌蒿鲜样（茎、叶），用自来水和去离子水反复冲洗干净，淋干水分，剪成碎片至于研钵内加液氮研成精细粉末，称取5g（0.5g）粉末溶于200ml（20ml）缓冲液混匀测ph=7.15（量多需等比例扩大）2、细胞破碎：将混合液分装入100ml三角瓶中，用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎。机器参数设置如下：6号变幅杆（10-100ml），超声时间3s，间隙时间3s，总时20min，温度21℃，功率45%。5、超、高速离心实验：（1）、将破碎溶液进行过滤（用两层纱布），上层残渣即为细胞壁部分（收集入冰箱保存待测），滤液为原生质体部分（包括各种细胞器和细胞液等），待离心。（2）将滤液分装入离心管，先用高速离心机进行初步离心实验，依据现有资料设置离心力和转速，参数如下：离心力（转数）所得沉淀600g（2400转）细胞核部分2000g（4000转）叶绿体部分10000g（9800转）20000g（13900转）线粒体部分（分级得到的线粒体可采用蔗糖密度梯度离心方法来纯化）（3）根据浓度梯度、根茎叶、嫩中老三个指标来进行实验（浓度单位：mg/L，mg/kg）离心前不同浓度、不同部位、不同时期镉的含量镉处理浓度离心前镉含量0510204080160嫩根嫩茎嫩叶中根中茎中叶老根老茎老叶离心后不同浓度、不同部位、不同时期镉的含量镉处理浓度离心后镉含量0510204080160嫩根嫩茎嫩叶中根中茎中叶老根老茎老叶细分的话：1、不同浓度、嫩苗期、根茎叶部位、不同转速下镉的含量不同浓度，600g嫩根离心镉含量（细胞核部分）600g嫩根510204080160不同浓度，10000g嫩根离心镉含量（线粒体部分）10000g嫩根510204080160不同浓度，600g嫩茎离心镉含量（细胞核部分）600g嫩茎510204080160不同浓度，2000g嫩茎离心镉含量（叶绿体部分）2000g嫩茎510204080160不同浓度，10000g嫩茎离心镉含量（线粒体部分）10000g嫩茎510204080160不同浓度，600g嫩叶离心镉含量（细胞核部分）600g嫩茎510204080160不同浓度，2000g嫩叶离心镉含量（叶绿体部分）2000g嫩茎510204080160不同浓度，10000g嫩叶离心镉含量（线粒体部分）10000g嫩茎5102040801602、不同浓度、中苗期、根茎叶部位、不同转速下镉的含量不同浓度，600g中根离心镉含量（细胞核部分）600g嫩根510204080160不同浓度，10000g中根离心镉含量（线粒体部分）10000g嫩根510204080160不同浓度，600g中茎离心镉含量（细胞核部分）600g嫩茎510204080160不同浓度，2000g中茎离心镉含量（叶绿体部分）2000g嫩茎510204080160不同浓度，10000g中茎离心镉含量（线粒体部分）10000g嫩茎510204080160不同浓度，600g中叶离心镉含量（细胞核部分）600g嫩茎510204080160不同浓度，2000g中叶离心镉含量（叶绿体部分）2000g嫩茎510204080160不同浓度，10000g中叶离心镉含量（线粒体部分）10000g嫩茎5102040801602、不同浓度、老苗期、根茎叶部位、不同转速下镉的含量不同浓度，600g老根离心镉含量（细胞核部分）600g嫩根510204080160不同浓度，10000g老根离心镉含量（线粒体部分）10000g嫩根510204080160不同浓度，600g老茎离心镉含量（细胞核部分）600g嫩茎510204080160不同浓度，2000g老茎离心镉含量（叶绿体部分）2000g嫩茎510204080160不同浓度，10000g老茎离心镉含量（线粒体部分）10000g嫩茎510204080160不同浓度，600g老叶离心镉含量（细胞核部分）600g嫩茎510204080160不同浓度，2000g老叶离心镉含量（叶绿体部分）2000g嫩茎510204080160不同浓度，10000g老叶离心镉含量（线粒体部分）10000g嫩茎510204080160最后总结变化趋势，绘制趋势图七、活性鉴定（细胞器鉴定）：将分离出来的沉淀用来镜检1、叶绿体：在洁净的载玻片上滴一滴清水，用镊子或者接种环取一块沉淀，盖上盖玻片，制成临时装片，用吸水纸吸取周边多余水分，用显微镜低倍镜观察，找到叶片细胞后，再换高倍镜观察、拍照。在高等植物中叶绿体像双凸或平凸透镜，长径5~10um，短径2~4um，厚2~3um。图片中看到的叶绿体大概为1.5cm即15mm换算：1m=10-2cm=10-3mm=10-6um=10-9nm10um（长径）*1600（放大倍数100*16）=10*10-6*1.6*103=16mm（与照片显示结果相同，可见，所看到绿色物体确定为叶绿体）2、线粒体：在洁净的载玻片上滴一滴詹纳斯绿染液，用镊子或者接种环取一块沉淀，盖上盖玻片，制成临时装片，用吸水纸吸取周边多余水分，用显微镜低倍镜观察，找到叶片细胞后，再换高倍镜观察、拍照。线粒体的形状多种多样,一般呈线状,也有粒状或短线状。线粒体的直径一般在0.5~1.0μm，在长度上变化很大,一般为1.5~3μm，长的可达10μm数量级大概是叶绿体的十分之一，因而上图中所看到的透明细胞器可能不是线粒体，3、细胞核：取核沉淀1滴涂于载玻片，加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用显微镜（40*）检查，细胞核呈紫红色，混杂的胞质为浅蓝色碎片。