海岛棉与陆地棉纤维C4H1基因克隆及表达分析

海岛棉与陆地棉纤维C4H1基因克隆及表达分析曹佳强1，2，吕淑萍2，李波2，杨洋2，张经博2，谢丽霞2，胡文冉2，范玲2（1新疆农业大学农学院，乌鲁木齐，830052；2新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐，830091）摘要：【目的】比较研究海岛棉与陆地棉纤维不同发育时期C4H1基因的表达和结构差异。【方法】分别从海岛棉和陆地棉纤维中克隆C4H1基因的cDNA全长，并利用DNAMAN、MEGA3.1等软件进行C4H1基因的生物信息学分析；采用半定量和实时荧光定量PCR方法，比较海岛棉和陆地棉不同发育时期的棉纤维中C4H1基因的表达水平。【结果】C4H1基因在海岛棉与陆地棉纤维发育不同时期表达具有差异，海岛棉中该基因的表达高峰期在20DPA，而陆地棉中该基因的表达高峰期在15DPA。该基因的核酸序列在两种棉花中存在差异，并导致其编码蛋白的氨基酸序列也存在差异，且海岛棉C4H1蛋白中Thr（苏氨酸）含量高于陆地棉，蛋白等电点也要高于陆地棉。【结论】海岛棉中C4H1基因的表达高峰期晚于陆地棉，两个棉种C4H1蛋白氨基酸序列的差异可能导致其理化性质及生物学功能的改变，该研究为发掘海岛棉纤维品质优异基因奠定了基础。关键词：陆地棉；海岛棉；基因克隆；纤维品质；基因表达C4H1GeneCloningandExpressionAnalysisbetweenSea-islandCotton(GossypiumbarbadenseL.)FiberandUplandCotton(GossypiumhirsutumL.)FiberCAOJia-qiang1,2,LVShu-ping2，LIBo2,YANGYang2,ZHANGJing-bo2,XIELi-xia2,HUWen-ran2,FANLing2（1.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China；2InstituteofNuclearandBiologicalTechnologies,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China）Abstract:【Objective】TocomparethedifferencesofC4H1geneexpressionandstructureindifferentperiodsoffiberdevelopmentbetweensea-islandcotton(GossypiumbarbadenseL.)anduplandcotton(GossypiumhirsutumL.)【Method】Thefull-lengthcDNAofC4H1genewasisolatedfromsea-islandcottonanduplandcottonfiberrespectively.UsedDNAMAN,MEGA3.1基金项目：国家自然科学基金（31460386）；新疆自治区农作物生物技术重点实验室开放项目（XJYS0302-2012-03）；新疆农业科学院优秀青年基金（xjnky-2012-005）作者简介：曹佳强（1989-），男，黑龙江牡丹江人，硕士研究生，研究方向作物分子生物学，（E-mail）[e-mail]通讯作者：范玲（1958-），女，新疆人，研究员，博士生导师，研究方向棉花纤维品质分子改良，（E-mail）[e-mail]-quantitativeinterpretationPCRandreal-timefluorescencequantitativePCRwereusedtocomparetheexpressionofthetargetgenesindifferentfiberdevelopmentperiodsbetweentwocottonspecies.【Result】TheresultshowsthatC4H1geneexpressionwasdifferentindifferentfiberdevelopmentperiodsbetweentwocottonspecies.TheexpressionpeakoftheC4H1appearedat20DPAinsea-islandcottonand15DPAinuplandcotton.ThenucleicacidsequencesandcodedaminoacidsofC4H1weredifferentbetweentwocottonspecies.TheThr’(threonine)contentandisoelectricpointofC4H1proteininsea-islandcottonwerehigherthaninuplandcotton【Conclusion】TheexpressionpeakofC4H1geneappearedinsea-islandcottonwaslaterthaninuplandcotton.ThedifferencesinaminoacidsequenceofC4H1proteinbetweenthetwocottonspeciesmightchangetheirphysicochemicalpropertiesandbiologicalfunctions.Thisdiscoverywouldcontributetoidentifythefunctionalgenesofsea-islandcottonthatmightimprovethefiberquality.Keywords:sea-islandcotton(G.barbadenseL.);uplandcotton(G.hirsutumL.);genecloning;fiberquality;geneexpression0引言【研究意义】棉花是当今世界上种植范围很广，经济价值较高的作物之一，其中四倍体的陆地棉和海岛棉为最主要的两个栽培棉种[1]。陆地棉产量比较高，适应性广，但是纤维品质比较差。海岛棉纤维品质优良，但生育期较长，产量低。在实际生产中，人们往往追求具有强度好，长度长，整齐度高，成熟度适中等优良品质的棉花纤维，因此培育具有这两个棉种优良品质的棉花品种是我国棉花工作者长期以往的奋斗目标[2]。【前人研究进展】木质素是植物细胞壁在次生壁逐渐增厚过程中的主要物质，它是维管植物细胞壁的重要组成成分[3]。前人研究发现木质素生物合成中存在苯丙烷途径、莽草酸途径，以及木质素合成特异途径等，这三种途径之间通过一系列复杂的生化反应，最终生成芥子醇、松柏醇与香豆醇3种主要木质素单体，它们通过不同的化学键作用而连接在一起[4]。肉桂酸-4-羟化酶（Cinnamate-4-hydroxylase,C4H）能够使肉桂酸C4位置上发生羟基化，它是苯丙烷类代谢途径的第一个羟基化酶[5]。研究者们在烟草[6]，杨树[7]，大豆[8]等多种不同植物中发现了C4H基因以及同源基因，证实了C4H基因在植物体内存在多基因家族。但是在棉花纤维发育过程中C4H基因及其同源基因所发挥的作用还要需要进行更加深入的探究。实时荧光定量PCR技术是指，通过在PCR反应体系中加入荧光物质，利用反应所产生的荧光信号积累，从而准确监测整个PCR反应体系的进程，最后通过制作标准曲线来定量分析未知模板[9]，是在原有PCR技术水平上的发展和革新，具有特异性强、定量速度快而准确、全封闭反应等特点,扩大了PCR技术的应用范围[10]。该技术现已经广泛应用于基因的差异表达研究：如李晓东等研究外源松柏醛和芥子醛对棉纤维中苯丙烷代谢途径基因的影响[11]，张献龙等筛选一部分持家基因对棉花纤维发育可能产生的影响等[12]。【本研究切入点】棉花纤维发育相关基因时空表达调控与棉纤维品质的形成关系可为研究棉纤维发育机理和纤维品质的改良奠定了一定的基础，通过分析和比较海岛棉和陆地棉C4H1基因的结构差异以及表达差异，对改良棉花的纤维品质具有一定的意义。【拟解决的关键问题】克隆海岛棉和陆地棉C4H1基因的全长cDNA序列，分析C4H1基因氨基酸序列的结构，比较海岛棉和陆地棉在纤维发育不同时期C4H1基因的表达差异，从而为今后实现棉花基因工程中棉纤维品质的改良提供了一定的基础1材料与方法1.1材料本实验所采用的材料是种植于新疆农科院玛纳斯实验基地的陆地棉（军棉1号）和海岛棉（新海20），用多种不同颜色毛线分别标记，同一种颜色只代表两种棉花的同一开花天数，并采集开花后5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、25DPA的棉铃，再用提前准备好的锡箔纸包裹好所采摘的棉纤维，把其迅速投入液氮罐，后贮存于-80℃冰箱中以备使用。1.2方法1.2.1RNA提取及均一化采用改良的热硼酸-蛋白酶K法[13]提取新海20与军棉1号5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、25DPA棉纤维的总RNA，所提取总RNA的A260/280值在1.8~2.0之间为可用，用核酸蛋白快速检测仪测定其总RNA浓度，并且将RNA浓度均一化在250ng/µL左右，并用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证RNA浓度，继续调整RNA均一化。将均一化的RNA反转录，获得总cDNA。1.2.2引物设计在北京大学朱玉贤实验室构建的棉花纤维文库中检索棉花C4H1基因相关cDNAESTs序列，并进行EST序列片段的拼接，再通过所得的拼接序列使用Primer5.0软件设计特异引物，正向引物序列F：(5'-CATCATCATGGACCTCCTCTTCCTAG-3')；反向引物序列R：(5'-ACTTGTTAAATCAAAACACCCTTGGCTT-3')。使用GhEF1α作为内参基因，内参基因序列参照文献[14]，所使用的引物正向引物序列F：(5'-AGACCACCAAGTACTACTGCAC-3')，反向引物序列R：(5'-CCACCAATCTTGTACACATCC-3')，引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。1.2.3cDNA全长序列克隆以所得的cDNA片段为模板利用对应引物进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶纯化回收试剂盒回收目的基因片段，将目的基因片段连接到T载体上，把转化成功后的菌液进行PCR检测，把检测结果呈阳性的菌液或提其质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。1.2.4C4H1基因的氨基酸序列分析利用DNAMAN软件和GenBankBlast以及Mega4.1[6]软件内置的ClustalW[15]程序进行海岛棉与陆地棉多重序列比对和同源性分析。使用Protparam来对C4H1基因进行生物信息学分析，如氨基酸序列组成、相对分子质量、等电点等理化性质。1.2.5半定量PCR以cDNA为模板利用对应引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20μL：2×TaqPCRMasterMix10μL，模板1.0μL，无菌ddH208.0μL，正反向引物各0.5μL。PCR反应程序：94℃预变性5min后；94℃变性45s，63℃退火45s，72℃延伸45s，重复35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像仪成像拍照，保存。1.2.6荧光定量PCR将测序结果正确的质粒进行梯度稀释，以稀释产物为模板来进行荧光定量PCR标准曲线的制作，荧光定量PCR以不同发育天数的棉纤维cDNA及梯度稀释质粒为模板，使用(2x)SYBRGreen/ROXqPCRMasterMix荧光定量PCR试剂盒，PCR反应体系为20μL：(2x)SYBRGreenMasterMix10μL，模板1.0μL，无菌ddH208.0μL，正反向引物各0.5μL。PCR反应程序参照(2x)SYBRGreen/ROXqPCRMasterMix荧光定量PCR试剂盒中的说明书，使用GhEF