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小鼠淋巴细胞刺激转化指数实验1.小鼠淋巴细胞悬液的制备1)小鼠脱臼处死,75%酒精浸泡2-3分钟。减少污染。2)将小鼠移入超净台内,仰卧固定在解剖盘,用眼科剪,镊子取出脾脏和胸腺(各1/2),放入装有2mLIMDM培养液的无菌平皿中。3)将消毒好的纱布,3-4层覆盖到组织上,直头镊子固定,弯头镊子轻压组织,用移液枪反复吹打。4)将悬液吸出,放入1.5mLEP管中,2000rpm,15-20min,吸取白色淋巴细胞层于无菌离心管中,用PBS缓冲液洗3遍。2细胞计数1)取上述制备好的细胞悬液混匀后,取出20mL,加到有980细mL胞计数液的EP管。2)取20微升到细胞计数板,计数,数出四个大方格的细胞总数Y.则悬液的浓度为Y/4×104×503)用含有20%血清的培养液调细胞浓度至1×107/mL。3.淋巴细胞培养1)取含20%血清的IMDM培养液(分别含有0g/mL,5mg/mL,10mg/mLConA)加入无菌96孔细胞培养板,每孔50mL)2)青链霉素的浓度最终应为100单位/ml。青霉素是160万单位(0.96g)/瓶,链霉素是100万单位(1g)/瓶,取青霉素0.06g,链霉素0.1g,加10ml灭菌双蒸水,配制成青链霉素1万单位的母液,过滤后分装在小EP管中。使用时,可取1ml母液放入100ml的培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。3)再加入调好浓度的淋巴细胞悬液,50mL/孔4)将上述培养板放入含有5%CO2的37℃培养箱中培养48-72h4、MTT1)结束培养前2h,在显微镜下观察细胞转化情况。2)每孔加入MTT5mg/mL,10mL/孔,将MTT和细胞混匀。3)在培养箱中继续培养2h4)取出后离心2000rpm,10min,弃去上清。5)每孔加入100mL二甲基亚砜,将颗粒溶解,过夜。6)用酶标仪测定OD值,波长570nm.
本文标题:淋巴细胞刺激指数
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