番石榴叶中人白细胞弹性蛋白酶抑制剂的研究

——————————————高月麒(1984-)男，主要从事天然药物研究工作。Tel:[phone]E-mail:[e-mail]番石榴叶中人白细胞弹性蛋白酶抑制剂的研究高月麒1，任风芝1，陈书红1，李丽红1，郑智慧1，何美莹2，张雪霞1（1、华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北石家庄050015；2、云南省热带作物科学研究所，云南景洪666100）摘要目的研究番石榴叶中的人白细胞弹性蛋白酶（HLE）抑制剂成分。方法通过溶剂提取、聚酰胺、硅胶柱色谱、SephadexLH20柱色谱和HPLC制备等分离纯化，得到活性化合物，根据理化性质和光谱数据鉴定化学结构，应用白细胞弹性蛋白酶抑制剂高通量的筛选模型进行评价。结果从番石榴叶中分离到的活性成分为2α-羟基-3β-（反-桂皮酰基）-12-烯-28-羧基乌苏酸(I)和2α-羟基-3β-（顺-桂皮酰基）-12-烯-28-羧基乌苏酸(II)的混合物，对人白细胞弹性蛋白酶有较强的抑制活性，其IC50值为1.50ug/ml。结论化合物II为首次从该植物中发现，该混合物的HLE活性首次报道。关键词：番石榴叶三萜白细胞弹性蛋白酶抑制剂StudyonhumanleukocyteelastaseinhibitorfromPsidiumguajavaL.GAOYue-qi1,RENFeng-zhi1，CHENShu-hong1，LlLi-hong1，ZHENGZhi-hui1，HEMei-ying2，ZHANGXue-xia1（1、NCPCNewDrugresearchanddevelopmentCO.,Ltd.,Shiiazhuang050015;2、Yunnaninstituteoftropicalcropsresearch,jinghong666100）ABSTRACT:OBJECTIVETostudyhumanleukocyteelastase(HLE)inhibitorconstituentsfromPsidiumguajavaL.METHODSTheactivecompoundswereisolatedbysolventextractionandchromatographyonPA、silicagel、SephadexLH20andHPLC.Theirstructureswereidentifiedbyphysicochemicalpropertiesandspectralanalysis.Ahighthrough-putscreeningmethodwasusedtoexploretheHLEinhibitor.RESULTSAmixturewasisolatedandidentifiedas2α-hydroxy-3β-(trans-p-coumaroyloxy)-urs-12-en-28-oicacid(I)and2α-hydroxy-3β-(cis-p-coumaroyloxy)-urs-12-en-28-oicacid(II),andthismixtureshowedsstronginhibitoractivityagainsthumanleukocyteelastasewithIC50of1.50ug/ml.CONCLUSION2α-hydroxy-3β-(cis-p-coumaroyloxy)-urs-12-en-28-oicacidisfirstfoundfromPsidiumguajavaL.,andthemixtureisreportedasahumanleukocyteelastaseinhibitorforthefirsttime.KEYWORDS:PsidiumguajavaL.;triterpene;humanleukocyteelastaseinhibitor人白细胞弹性蛋白酶（humanleukocyteelastaseHLE）是人体中的一种主要的蛋白酶，它的直接作用底物是肺、肝脏、肾脏等结缔组织中的弹性蛋白、胶原蛋白、蛋白多糖等胞外基质。体内弹性蛋白酶酶表达过多或活性过高均可导致严重的组织损伤，并造成或加重多种肺气肿、慢性支气管炎、脓血症、肾炎、类风湿关节炎和某些皮肤症等疾病[1]。另外由于弹性蛋白酶可以破坏胶原纤维及组织基底膜层，在肿瘤的形成和肿瘤转移方面起关键作用，所以弹性蛋白酶成为抗癌新药的作用靶点[2]。利用该模型从植物提取物库中筛选到番石榴叶具有很好的活性，经过追踪分离，得到活性成分。本文阐述了其提取分离、结构鉴定和生物学活性。1仪器和材料人白细胞弹性蛋白酶（HumanLeukocyteElastaseHLE）,多肽底物均(购自Sigma公司)；Victor２多标计数仪（美国PE公司）；INVOA500型核磁共振波谱仪(Volian)；ZMDMicromass型质谱仪(Micromass公司)；柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂)，SephadexLH-20（安玛西亚公司）；薄层色谱用硅胶板及色谱纯甲醇(Merk公司)；显色剂为1％三氯化铝乙醇溶液和15%硫酸-乙醇溶液。其余试剂均为分析纯。HPLC为waters996型仪,固定相用C18柱(Phenomenex250mm×21.2mm,10μm)。药材番石榴叶采自云南省热带作物科学研究所内。2提取与分离将干燥的番石榴叶500g粉碎，用70%的乙醇提取两次，每次加10倍量溶剂，提取液浓缩后进行聚酰胺柱层析，依次用20%、50%、80%、95%洗脱，80%和95%乙醇洗脱部分合并进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱（10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、甲醇），氯仿-甲醇10∶1部分经LH-20凝胶柱层析和HPLC制备，得活性化合物I和II的混合物（20mg）。结构见图1：OOHOOHOHOOOHOOHOOH化合物I化合物II图1化合物I和II的结构示意图3结构鉴定化合物Ⅰ：分子式为C39H54O6，ESI(+):641。1H-NMR(C5D5N，500MHz)δ：7.58(d，1H，J=16.5Hz，H-α)，7.42(d，1H，J=8Hz，H-2′，6′)，6.76(d，1H，J=8Hz，H-3′，5′)，6.35(d，1H，J=16.5Hz，H-β)，5.19(m，1H，H-12)，4.01(m，1H，H-3)，3.52(brs，1H，H-2)，1.13，1.10，1.06，1.02，0.99，0.96，0.92(s，each3H)，13C-NMR数据见表1。其波谱与文献[3]报道一致，为2α-羟基-3β-（反-桂皮酰基）-12-烯-28-羧基乌苏酸。化合物Ⅱ：分子式为C39H54O6，ESI(+):641。1H-NMR(C5D5N，500MHz)δ：7.60(m，1H，H-α)，6.83(d，1H，J=13Hz，H-2′，6′)，6.68(d，1H，J=8Hz，H-3′，5′)，5.81(d，1H，J=13Hz，H-β)，5.19(m，1H，H-12)，4.01(m，1H，H-3)，3.52(br.s，1H，H-2)，1.13，1.10，1.06，1.02，0.99，0.96，0.92(s，each3H)，13C-NMR数据见表1，确定化合物Ⅱ为2α-羟基-3β-（顺-桂皮酰基）-12-烯-28-羧基乌苏酸。表1化合物I和II的13CNMR数据（C5D5N，125MHz）13C-NMR化合物I化合物II13C-NMR化合物I化合物II13C-NMR化合物I化合物IIC-148.649.0C-1443.343.3C-2724.124.5C-267.567.6C-1529.229.3C-28181.6181.6C-385.285.5C-1625.326.1C-2921.621.6C-439.239.2C-1748.648.9C-3018.218.2C-556.556.5C-1854.354.3C-γ168.6169.6C-618.419.4C-1940.640.6C-β115.8107.2C-733.134.1C-2040.840.8C-α144.8144.8C-840.440.4C-2131.830.8C-1′127.3127.8C-948.548.8C-2238.138.1C-2′131.1133.7C-1038.138.1C-2329.230.2C-3′116.8117.4C-1123.823.8C-2417.217.3C-4′161.2`61.2C-12126.6126.6C-2517.717.7C-5′116.8115.7C-13139.8139.8C-2617.817.8C-6′131.1133.74HLE活性测定HLE测活原理与方法参考文献[4]，以化学标记的多肽-nitroanilide为底物，测定酶反应前后OD值的变化。反应式如下：多肽-Val-nitroanilide多肽+nitroanilide（405nm）筛选的操作过程为：在96孔板中加入测试样品，加HLE酶液100μl。使用1420Victor2多标计数仪在410nm波长下，读取每孔OD值（样品本底OD）；加入底物100μl，37℃保温反应120分钟后再次读取每孔的OD值，并计算抑制率。取浓度梯度的混合物对HLE进行活性测定，该混合物对HLE的抑制作用呈现较好的浓度依赖性的关系，有较强的抑制活性其IC50为1.50μg/ml。5讨论番石榴叶为桃金娘科植物番石榴(PsidiumguajavaL.)的干燥叶，在巴西、中国广东、广西等民间广泛用于治疗腹泻，疗效甚佳。本实验结果显示该植物中的乌苏酸类三萜化合物具有很强的抗白细胞弹性蛋白酶的活性。文献报道乌苏酸具有广泛的生物活性，包括抗癌、对肝损伤的保护作用、抗菌消炎和抗病毒等作用[5]，由此推断该类化合物的作用机理之一有可能与其抑制HLE相关。据统计，近几年来肺部感染的人数增长迅猛，目前为止，急性肺损伤的治疗，临床上缺少侯选药，所以对番石榴叶进行深入研究，开发弹性蛋白酶抑制剂药物具有非常重要的意义。References：[1]TremblayGM,JanelleMF,etal.Anti-inflammatoryactivityofneutrophilelastaseinhibitors.CurrOpinInvestigDrugs.2003,4(5):556-65.Review[2]DonaM,etal.Hyperforininhibitscancerinvasionandmetastasis.CancerRes.2004,64(17):6225-32[3]WANGQiong,JUPeng,WANGYi-Fen,LUOShi-De.TriterpenoidsfromSaurauianapaulensis(Saurauiaceae).ActaBotanicaYunnanica.2008,30(1):121~124[4]TanakaH,ShimazuT,etal.AsensitiveandspecificassayforgranulocyteelastaseininflammatorytissuefluidusingL-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valine-p-NA..ClinChimActa.1990,187(2):173-80.[5]熊斌，雷志勇，陈虹.熊果酸药理学研究进展.国外医学·药学分册，2004，31（3）：133-136.HLE