病理制片技术手册

病理制片技术手册第一章病理标本的接收第二章组织固定第三章取材第四章组织脱水第五章包埋第六章组织石蜡切片第七章常规染色第八章封片第九章冷冻切片的制作第十章常用特殊染色第十一章常用试剂及染液的配制第一章病理标本的接收病理标本的接收是在取材、固定组织前首先要做的第一步工作，它是临床与病理科交接的一个重要环节，它为开展病理学检查、病理档案的保存奠定了基础。标本接收程序如下。1．首先核对病理申请单与标本上的红色号码是否一致。2．核查病理申请单上写明的送检标本及数目是否与实际送检标本一致。3．观察送检标本的大小及固定液比例是否合适。(1)穿刺活检及纤支镜所取的小标本，4％中性甲醛(10％中性福尔马林)固定组织的量应在6～10倍。(2)对于较大的手术切除标本，应及时切开固定；核对后将病理申请单和标本编上病理标本号。4．将病人姓名、性别、年龄、病历号、科别、临床诊断、部位、标本来源、标本例数等逐项录入电脑存储。5．作为病理资料不仅要做好计算机录入工作，还须进行文字登记，以便病理档案长期保存。第二章组织固定一、固定的目的和意义活体组织一旦停止血液循环和物质代谢就会因物质代谢障碍产生一系列的生物化学和组织化学改变，并导致形态学上可见的细胞器变化和细胞组织的形态改变直至腐败自溶。固定的目的就是要通过使用化学和物理的方法，尽可能地保存组织细胞离体时具有的生理和病理形态结构及生物化学和免疫化学成分。良好的固定是制作优秀病理切片的基础，也是特殊染色、组织化学、免疫组织化学和组织原位分子杂交等技术方法赖以成功的基础。因此，在病理技术工作中必须高度重视固定的质量。二、组织固定的注意事项1．及时取材：由于甲醛对组织的平均穿透速度只有0.8mm/h，因此手术切除的送检标本应及时切开进行取材，以便保证重要的镜检部位能及时地得到固定。2．及时固定：完成取材的组织块应立即投入固定液以便尽可能地保存组织细胞的形态结构和抗原性。3．液量充分：一般情况下要求固定液的量应为组织体积的6～10倍。4．适度固定：现代固定的要求是，在良好保存组织细胞形态结构的同时尽可能较好地保存组织细胞的抗原性。长时间的固定会导致某些组织抗原性的逐渐丧失，因此，适时固定可以在保存细胞结构和抗原性之间取得必要的平衡。对于较大的送检标本而言，在及时切开固定的基础上，应尽可能在24h以内取材进入组织脱水程序。5．适宜温度：低温可以降低固定的速度，反之可以加快固定进程。在自动组织脱水机上可以施加恒定的温度使得在有限的时间内可以完成固定过程。一般情况下应将固定温度控制在36~38℃。6．适当搅拌：在自动组织脱水机上可以通过使用搅拌和试剂循环功能使固定过程在标本与试剂充分接触的条件下完成。三、固定液的选择影响标本固定的因素很多，如组织与固定液的比例、固定时间、固定温度等；除此之外，固定液本身也很重要，若所选固定液不当，细胞内蛋白质、脂类、核酸等成分将会有不同程度地损失。固定剂最好随配随用，并注意其浓度和酸碱度。因此根据实际工作的目的，选用合适的固定液非常重要。下面是一些常用固定液的配制方法及适用范围。1．单纯固定液(1)4％中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。一般无特殊要求的病理标本均适用。尤其值得注意的是，中性甲醛是以pH7．2～7．4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4％甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。甲醛(40%)100ml无水磷酸氢二钠6.5g磷酸二氢钠4.0g蒸馏水900ml(2)乙醇固定液：使用时以80％～95％的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，如果用于证明尿酸结晶和保存糖原，可用100%乙醇固定组织。(3)4％的多聚甲醛：主要用于培养细胞的固定。2．混合固定液(1)乙醇一甲醛(乙醇－福尔马林，AF)固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95％乙醇脱水。甲醛(40％)100ml95％乙醇900ml(2)B5(醋酸钠一升汞一甲醛)固定液：多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。无水醋酸钠1.25g升汞6.0g蒸馏水90ml使用前加入甲醛10ml(3)Bouin固定液：特别适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。需现配现用。饱和苦味酸水溶液(约1.22%)75ml甲醛25ml冰醋酸5ml(4)Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，特别适合于固定外膜致密的组织，亦适用于糖原及尼氏小体的固定。无水乙醇60ml氯仿30ml冰醋酸10ml(5)Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清晰，但成本较昂贵且需特殊处理汞。该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。升汞5.0g重铬酸钾2.5g硫酸钠1.0g蒸馏水(加至)100ml四、操作方法临床医师切取标本后，应尽快将标本置于盛有足够量固定液的容器内，尽量避免可能出现固定不及时或不充分导致标本干涸或腐败，无法进行切片制作。病理科工作人员验收标本后，必须对临床初步固定的标本及时进行规范的处理：对于穿刺及胃肠镜所取的小标本，直接添加中性甲醛，添加的量应6～10倍于标本体积；对于较大的手术切除标本应呈书页状切开、有包膜的标本切开固定，切开的厚度1cm左右，为了保存标本的原有大体形态，切开时最好不要完全断开，两切面之间用脱脂棉或纱布隔开，然后放人6～10倍体积的固定液中完全淹没。特殊标本特殊处理：如脾脏或淋巴结等包膜较厚，固定剂渗透力有限，应切薄薄的一小片单独固定，对于宫颈锥切标本及胃肠等空腔器官应及时钉板展开固定。固定到取材的时间应视标本的大小及切面的厚度而定，小标本应不少于4h,大标本不少于18h。第三章取材一、概念取材是将送检标本进行客观描述并将病变部位组织切成厚薄适度的小片后装入小盒(进入组织脱水程序)，取材至关重要。二、取材环境取材室由取材台、记录桌、标本陈列架、电脑查询等组成；取材台应有良好的排风、进出水系统，配备齐全的刀、剪、镊、尺等基本工具和备用固定剂，记录桌应备有打号机(无时应用铅笔)、记录纸张、标本小盒及盒盖等，标本陈列架应存放、拿取方便、排风良好，电脑查询应与登记台和医师诊断记录结果的计算机相连。三、操作1．首先进行核对：记录者拿出一份申请并唱出病理号，取材医师按病理号拿出一份标本，核对无误后唱出申请单编号，记录者核对无误后念出申请单上填写的取材部位和送检标本份数及具体块数，取材医师核对无误后对标本进行具体描述。2．对送检标本的观察和描述：可分为活检小标本(包括经内窥镜获取的黏膜组织、浅表或深在部位的穿刺物、子宫腔刮取物、经微创手术由器官或肿瘤中切取的不完整组织等)和手术大标本。(1)小标本检查：描述送检标本的数量(量少时精确计数)、大小(量少时精确测量，量多时聚堆测量体积)、色泽、形状以及质地等。(2)大标本检查：①检查切除标本的手术类型。②测量标本的大小；描述标本的形状、色泽、有无包膜或被膜及质地，必要时(如内分泌肿瘤)要在切开标本前称重；带有脏器的标本还应注意检查病变与有关脏器的比邻关系。③按操作规范切开检查标本切面，如实性区域观察色泽、质地、纹理、有无出血坏死以及肿瘤肉眼浸润深度和范围；囊性区域观察囊肿壁的厚度、内外表面、内容物及其性状等。④注意各系统脏器大体检查的特殊要求。⑤必要时绘制简图说明标本大体特点和解剖关系，也可进行表面及剖面摄影，以保存大体资料。3．组织取材：按病理诊断和研究的目的和要求，从标本上切取适当大小和数目的组织块，供后续制片和显微镜下观察用于诊断以及相关研究。取材的一般原则如下。(1)认真地进行大体检查，准确选取病变部位。(2)显示病变全貌，切取有代表性的病变区域组织，包括病变周边相对正常的组织和坏死组织等；对有肿瘤的标本应包括切缘、肿瘤包膜及转移部位等。(3)组织块的面积通常为2.0cmX1.5cm，厚度不超过3.0mm。太大太厚的组织块常会固定不充分，而影响脱水和制片。组织块的数量依具体情况而定，一般以满足诊断和相关研究需要为准。(4)骨或钙化组织需要先经脱钙处理；腔道器官及囊壁组织应立埋。4．记录：大体检查和取材要由具备一定经验的病理医师进行，应配备人员进行记录。记录人员负责如下事宜。(1)每例标本在病理医师进行大体检查和取材前，与其共同核对该例标本份数、内容、病变特征及其标志是否与申请单相关内容一致。(2)病理医师在进行大体检查和取材时，记录人员根据申请单向医师报告病人基本情况、术中所见、送检医师特殊要求等，并如实清楚地将病理医师口头描述记录于记录单上，必要时绘制简图显示大体所见及标示取材部位。(3)病理医师取材完毕后，与其共同核实取材内容，确保组织块及其编号标签准确置人脱水盒内，并在记录单和取材工作单上签名并签署日期。5．注意事项(1)核对要认真，描述要客观，取材要准确。(2)每例标本取材前后，均应用流水彻底清洗取材台面和所有相关器物，避免交叉污染。(3)细小标本取材时可用伊红点染并用滤纸包裹，严防标本丢失。(4)大标本取材大小要适当(组织块的面积通常为2.0cm×1.5cm，厚度不超过3.0mm)(5)取材刀刃要锋利，避免使用钝刀或齿镊过度挤压组织，取材动作要轻柔，不可来回切割或过度牵拉组织，以免组织结构变形或内部细胞脱落。(6)组织块切面应平整，如有线结和钢丝应拔除。(7)所取组织应包括各脏器的重要结构或全层。(8)特殊标本要在取材前照相留资料。第四章组织脱水组织经固定后会有大量水分，组织脱水是用某些溶剂逐渐将组织内的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡的渗入。一、手工脱水1．器械准备：大标本缸6个，浸蜡用金属缸3个，脱水篮，恒温烤箱。2．日常工作程序见表5．1。表5．1手工脱水日常工作程序表5．1手工脱水日常工作程序试剂浓度／温度时间设定中性缓冲甲醛4%3.00h乙醇80%1.00h乙醇90%1.00h乙醇95%过夜无水乙醇I2.00h无水乙醇Ⅱ2.00h二甲苯一无水乙醇体积比为1:130min二甲苯I30min二甲苯Ⅱ1.00h石蜡60℃1.00h石蜡60℃1.00h石蜡60℃1.00h3．注意事项(1)所用标本缸要大一些，达到组织块与液体比6～10倍。(2)固定液、脱水剂要勤更换，可以采用前移更换。(3)二甲苯时间不宜过长，不要超过2h。(4)石蜡温度不得高于60℃。(5)所有程序应每间隔0．5h摇动2～3次以利于固定脱水浸蜡彻底。二、半自动脱水机半自动脱水机日常工作程序可参考全手工脱水日常工作程序进行。梯度乙醇的脱水时间加长。注意事项同手工脱水。三、全自动密闭式脱水机全自动密闭式脱水机有控制面板、处理槽、石蜡箱和试剂柜四个部分。为保证组织处理无刺激味道，全自动密闭式脱水机还设有活性炭过滤器。(1)控制面板有显示屏和小键盘，可由此输入20个不同的处理程序，可设置处理时间和温度，可启动P/V循环(压力和真空交替)和混合循环，出现故障时有报警提示。(2)处理槽是组织块进行处理的容器。(3)石蜡箱可将熔化的石蜡保持在设定的温度待用。(4)试剂柜装有处理试剂。1．日常工作程序见表5．2。表5．2全自动密闭式脱水机脱水日常工作程序溶液百分浓度时间设定温度（℃）P/V循环（压力和真空交替）混合循环中性缓冲甲醛液42.00h35＋＋乙醇801.00h－－乙醇951.00h－－乙醇951.00h＋＋乙醇951.00h＋＋乙醇1001.00h－－乙醇1001.00h＋＋乙醇1001.00h＋＋二甲苯1000.50h－－二甲苯1001.00h＋＋石蜡1.00h60－—石蜡1.00h60＋＋石蜡1.00h60＋＋石蜡1.00h60＋＋注：截止时间为1/8：00am2．双休日工作程序：脱水程序及各试剂的所用时间及功能相同，只将截止时间调至3/8:00am即可。3．外检小标本工作程序见表5．3。表5．3全自动密闭式脱水机外检小标本工作程序试剂浓度（％）时间设