皂角刺总黄酮诱导肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

1皂角刺总黄酮诱导肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究何光志1何前松1冯果1危英1王安宇1李世军2吴玛莉2魏良纲1王文佳1王平1曹锋1黄高1安传伟1安传相3（1，贵阳中医学院；2，贵州省疾病预防控制中心；3，贵阳学院，贵州贵阳550005）摘要:目的：探讨皂角刺总黄酮诱导肝癌HepG2凋亡。方法：应用流式细胞术分别检测肝癌HepG2细胞线粒体跨膜电位；建立肝癌荷瘤模型后连续给药皂角刺总黄酮，检测外周血中CD3+、CD4+、CD8+及NK细胞的百分含量并检测血清中IL-2和TNF-α的浓度。结果皂角刺总黄酮能使线粒体跨膜电位降低，与药物浓度呈负相关;与对照组比较,皂角刺总黄酮能显著上调小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.05）、CD8+（P＜0.05）及NK细胞（P＜0.01）的百分含量及血清中IL-2和TNF-α（P＜0.01）的表达水平。结论皂角刺总黄酮诱导肝癌HepG2凋亡可能与线粒体通路和干预机体免疫功能，诱导肿瘤凋亡，从而达到抑制肿瘤生长起作用。关键词：皂角刺总黄酮；线粒体跨膜电位；细胞因子肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,占全部恶性肿瘤的41%[1]。20世纪以来，在我国，肝癌在城市仅次于肺癌,在农村仅次于胃癌,我国肝癌已上升为恶性肿瘤的第二位[2]。原发性肝癌发病隐匿,迅速发展,患者生存期短。目前,手术是早期肝癌治疗的首选方法,放疗和化疗则是中晚期肝癌及转移性肝癌常用的治疗方法。然而,手术疗法复发率较高;而放疗和化疗伴有明显的毒副反应[3]。而以中医药为主的综合治疗,对控制肝癌患者病情发展,提高生活质量,延长生存时间有着重要价值。因此，寻找高效低毒的中医药已经成为国内外医药学家追寻的目标。皂角刺(GleditsiasinensisLain)是我国传统中药材，具有较强的抗肿瘤作用，已被列为抗癌中草药之一，可用于多种肿瘤的治疗。皂角刺总黄酮是皂角刺的提取物。黄酮类化合物是一类天然有机化合物,广泛存在于许多药用植物中,具有多种潜在的药用价值,其抗肿瘤作用的研究已经由来已久,从20世纪70年代起就有人发现黄酮类化合物具有较好的抗肿瘤作用[4]。据研究报道：黄芩甙能诱导肝癌细胞BEL27402凋亡和半枝莲提取物可有效诱导肝癌H22细胞凋亡,其机制可能与降低肿瘤细胞线粒体膜电位有关[6]。曹学锋等为了探讨中药皂角刺总黄酮的免疫调节作用,利用酶联检测其皂角刺总黄酮作用小鼠腹腔巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF)的情况,发现皂角刺总黄酮对TNF有明显的抑制作用[7]。1材料与试剂小鼠，雌雄各半，15～18g，购自贵阳医学院实验动物中心；CD3+、CD4+、CD8+抗体及成套试剂盒,购自美国RD公司；interleukin-2（IL-2）、tumornecrosisfactor－α（TNF-α）放免试剂盒，购自购自北京华英生物技术研究所;TUNEL检测试剂盒,购自罗氏公司；皂角刺总黄酮,由本课题组制备保存；RPMI-1640培养液,购自凯基生物科技发展有限公司;新生胎牛血清,购杭州四季青生物公司；凯基细胞凋亡罗丹明123染色试剂盒,购自南京凯基生物科技发展有限公司；BDFACS-Aria流式细胞仪,美国BD公司生产。2方法1.1线粒体膜电位的检测1.1.1细胞培养及分组用含10%新生胎牛血清的RPMI-1640培养液（含双抗）,在5%CO2的37℃培养箱中培养。实验设空白对照组和经皂角刺总黄酮处理的实验组,随机选取对数期生长的肝癌HepG2分成5份,其中4份分别加入皂角刺总黄酮溶液使其终浓度分别为0.4,0.8,1.6,3.2mg/ml作为实验组。其中1份,加入与实验组等量体积的培养液作为阴性对照组。21.1.2线粒体膜电位的检测两组细胞孵育24h后,经消化后用冷PBS（pH7.2）悬浮。取细胞数为1×106个/mL离心管内离心,冷PBS洗涤3次后，移至流式测定管内离心,用100�l结合缓冲液悬浮细胞。随后加入罗丹明123染液10mg/mL,置于37℃5%CO2培养箱孵育20min,取出离心后用培养液洗涤2次,上流式细胞仪检测。实验重复3次。1.2皂角刺总黄酮对荷瘤小鼠免疫功能的影响1.2.1动物模型建立抽取HepG2传代第7d的小鼠腹水2mL，在无菌条件下，采用灭菌生理盐水配制成浓度为2×107个/mL的接种用瘤液。20只小鼠皮下注射接种用瘤液0.2mL。1.2.2动物分组及指标检测将20只皮下注射接种用瘤液的小鼠随机分为对照组和给药组，另外设10只正常小鼠作为正常组，对照组和正常组均用生理盐水进行灌胃，用药组采用皂角刺总黄酮按照0.25g／kg剂量进行灌胃，对照组、正常组和用药组均每日灌胃2次。灌胃给药5d后眼球采血法获得外周血，具体操作参照试剂盒说明书采用流式方法检测CD3+、CD4+、CD8+及NK细胞的百分含量和采用放射免疫方法检测血清中IL-2、TNF-α的水平。1.3统计学处理所有实验数据均采用SPSS15.0软件进行统计分析，数据采用（x±s）表示。3结果3.1线粒体跨膜电位的检测皂角刺总黄酮处理肝癌HepG2作用24h,经罗丹明123染色后采用流式细胞仪检测。结果显示:与对照组相比，皂角刺总黄酮处理组均明显低于对照组,有极显著差异(P0.01),且随皂角刺总黄酮作用浓度的增高而减少,呈为负相关，结果见表1。表1线粒体跨膜电位的检测结果(x±s)组别含量(mg/L)阳性数对照组用药组0.40.81.63.285.26±1.4620.05±2.06**67.46±1.36**##67.30±0.59**##5,5.24±1.72**##注：*与对照组比较,**P＜0.01;#与对照组比较,##P＜0.012.2小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+及NK细胞百分含量的测定与对照组比较,用药组能显著上调小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.01）、CD8+（P＜0.01）及NK细胞（P＜0.01）;与正常组比较,用药组能显著上调小鼠外周血CD3+（P＜0.01）、CD4+（P＜0.01）、CD8+（P＜0.01）及NK细胞（P＜0.01）结果见表2。表2小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+及NK细胞百分含量组别CD3+/％CD4+/％CD8+/％NK/％正常组50.82±3.4137.86±2.6312.61±0.469.25±0.72对照组32.73±1.92**21.54±1.55**7.62±0.23**5.75±3.45**用药组42.22±2.95**##31.58±1.96**##10.47±1.02**##14.32±0.70**##3注：*与正常组比较，**P＜0.01；#与对照组比较，##P＜0.01。2.3小鼠血清中细胞因子IL-2和TNF-α的表达小鼠血清中细胞因子TNF-α和IL-2的浓度采用放射免疫标记的方法进行检测。对照组中TNF-α含量最低（1.25±0.35），药物干预后TNF-α（2.54±0.43）明显升偏高且接近正常组的值（2.72±0.52）（P＜0.01）。小鼠血清中细胞因子IL-2的浓度测定结果为，与正常组（2.32±0.43）和对照组（2.53±0.57）比较，用药组小鼠血清中细胞因子IL-2（3.29±0.49）显著升高（P＜0.01）。4讨论4.1李荣采用皂角刺总黄酮作用于HCTll6细胞,透射电子显微镜检测显示，经皂角刺总黄酮处理后的细胞出现线粒体肿胀，细胞质浓缩，核固缩，核内染色质聚集于核膜内侧成团块状或新月状等凋亡改变。线粒体通路是抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡的一条重要途径。线粒体是细胞进行呼吸链、电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化的场所，故线粒体也是细胞能量的场所，如果线粒体发生病变则会影响危及细胞生命。在细胞凋亡过程中，线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置，线粒体通路是最普遍的细胞凋亡机制。本研究采用应用流式细胞术分别检测皂角刺总黄酮肝癌HepG2细胞线粒体跨膜电位变化，研究提示皂角刺总黄酮诱导肝癌细胞凋亡可能是通过某些途径引起线粒体跨膜电位的下降,进一步导致MMP通道开放的结果。4.2刘明华等建立小鼠肉瘤S180及小鼠肝癌H22移植性肿瘤模型,观察皂角刺提取物对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用，结果发现皂角刺提取物在50、100mg/kg时对S180的生长抑制率分别为44.59%、53.38%,对H22生长抑制率分别为39.88%、46.63%,且能提高荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数和提高荷瘤小鼠细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α等细胞因子的表达水平[8]；张宏文和王占彬对产自伏牛山区野生皂角刺,用醇提取法提取黄酮类化合物等生物活性物质,研究其对肉仔鸡免疫功能的影响，研究结果显示：日粮中添加皂角刺提取物,可以提高免疫器官重量和淋巴细胞转化率,并有显著促生长作用(P0.05)[9]。受这些研究成果的启发：本研究采用建立肝癌荷瘤模型后连续给药皂角刺总黄酮，检测外周血中CD3+、CD4+、CD8+及NK细胞的百分含量并检测血清中IL-2和TNF-α的浓度。结果与对照组比较，皂角刺总黄酮显著上调小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.05）、CD8+（P＜0.05）及NK（P＜0.01）细胞的百分含量及血清中IL-2和TNF-α（P＜0.01）的表达水平。结论皂角刺总黄酮诱导肝癌HepG2凋亡可能与皂角刺总黄酮干预机体免疫功能，诱导肿瘤凋亡，从而达到抑制肿瘤生长起作用。【参考文献】[1]陈春林,张仲达.在体女性盆腔动脉血管网数字化三维模型构建方法及意义[J].中国实用妇科与产科杂志.(04)[2]徐玉静,欧阳振波,刘萍,陈春林.磁共振成像在子宫肌瘤动脉栓塞术中的应用价值[J].中国实用妇科与产科杂志.2011(04)[3]方驰华,苏仲和.数字医学技术在胰腺肿瘤诊断和可切除性评估中的研究[J].实用医学杂志.(10)[4]欧阳振波,刘萍,余艳红.女性骨盆研究进展及意义[J].中国实用妇科与产科杂志.(02)[5]刘萍,余艳红,陈春林,欧阳振波,宋小磊,王宏琢,昌仁民,王建平.CT扫描计算机三维重建女性骨盆的研究方法和应用[J].中国实用妇科与产科杂志.2010(01)[6]欧阳振波,张仲达,刘萍,陈春林,唐雷,李泽宇,黄睿,钟光明,梁波,全显跃,刘畅,钟世镇.宫颈癌子宫动脉血管网模型的构建及其三维可视化研究[J].中国临床解剖学杂志.2009(06)[7]吴龙,周义军,高劲松,孙建永,李玉飞,马俊,金科.女性盆腔的MRI三维重建[J].第四军医大学学报.(12)4[8]张绍祥.数字化人体与数字医学的研究概况及发展趋势[J].第三军医大学学报.(01)[9]高成杰,张仲达,裴强,徐达传.成人盆腔血管多层螺旋CT三维重建初步研究[J].中国临床解剖学杂志.2006(01)[10]单锦露,张绍祥,刘正津,谭立文,林支付,唐泽圣.中国数字化可视人女性盆腔的计算机三维重建[J].解剖学杂志.2005(03)[11]续靖宁,邓晓红.子痫前期患者血清游离脂肪酸浓度测定的临床意义[J].右江医学.2009(02)[12]刘增佑,朱艳宾,王淼,崔艳双,张仲达,胡群英.巨噬细胞集落刺激因子与妊娠期高血压疾病相关性的初步探讨[J].中国妇幼保健.2010(31)[13]佟艳,张晶,钱荣华,李蕊.血清钙水平与妊娠期高血压疾病的关系分析[J].河北医药.(24)[14]林丽珍,杨茵.妊娠期高血压疾病的临床预测研究进展[J].中国优生与遗传杂志.2010(11)[15]狄海红.妊