研究进展-PVY

1.2马铃薯Y病毒的生物学特性与基因组结构特征1.2.1马铃薯Y病毒的生物学特性马铃薯Y病毒（PotatovirusY，PVY）是马铃薯Y病毒属的典型成员，能侵染茄科、藜科、豆科、葫芦科等多种植物，是烟草、马铃薯、番茄和辣椒等多种茄科作物病毒病的主要病原之一，并常与烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）混合侵染，严重影响烟草品质，造成巨大的经济损失。在Potyvirus属病毒的分类上，一般广泛接受的是，1988年Shukla和Ward提出的Potyvirus属的划分标准，即CP的氨基酸序列同源性在38%-71%之间（平均54%）的为不同种的病毒，在90%-99%之间的为同一个种病毒的不同株系，大于99%的为同一株系的不同分离物[35]。按照这一标准，可以将常见的PVY株系分为3个株系：PVY-O称为普通株系，可以引起马铃薯严重的皱缩或条纹落叶病以及烟草的系统斑驳症状；PVY-N称为脉坏死株系，引起绝大多数马铃薯栽培品种叶片无症或很轻度的斑驳病症，造成烟草严重的系统脉坏死；PVY-C称为点条纹株系，可以在许多马铃薯栽培品种上引起条痕花叶症状等过敏性反应[36]，在其它一些品种上造成系统性花叶，而在烟草上症状与PVY-O的类似[37]。1.2.2马铃薯Y病毒的基因组结构与功能马铃薯Y病毒蛋白是多聚蛋白，PVY含有大小约10kb的正单链RNA基因组。该基因组仅含一个长的开放阅读框架（ORF），进行表达时先翻译成一个大的多聚蛋白（图2），再通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白加工成成熟的蛋白质来行使各种功能。马铃薯Y病毒病毒编码的多聚蛋白含有以下蛋白：P1主要功能是在多聚蛋白加工（蛋白酶）、基因组复制、症状表达等起作用，此外还是序列特异基因沉默的辅助因子；HC-Pro主要功能是在基因组扩增、自身互作、系统移动、抑制基因沉默、细胞间及长距离运输、协生和症状表达、种传等方面起作用；P3主要影响基因组复制、多聚蛋白加工，此外P3还是RsvI介导的致死性系统过敏反应的激发子[38]；6K1主要功能是与膜结合、参与复制、PSbMV中决定无毒性；CI在细胞间运动、复制（RNA解旋酶）、症状产生等方面起作用；6K2具有膜结合功能、参与复制、系统移动；NIa蛋白酶，以顺式及反式方式起作用，可以结合RNA，是Rym介导性的激发子，具有Dnase活性[39]；Nib可以参与病毒基因组的扩增；外壳蛋白CP参与细胞间长距离运输，蚜虫传播和基因组扩增。此外，PVY5′端非编码区VPg蛋白在5′端的结合过程、病毒粒子的起始装配或RNA复制酶的识别信号等方面起到相关作用。PVY的终止密码子与Poly(A)之间有一段3′端非编码区，可能在负链RNA的复制起始中发挥作用[40,41]。1.2.3PVYHc-pro基因的功能研究HC-Pro是一个多功能蛋白，参与病毒生活史中的许多过程。Atreya（1993）、Kle（1994）等在研究烟草脉斑驳病毒（TVMV）时发现HC-Pro蛋白参与病毒自身的复制和症状的表现[42,43]。Klein（1994）发现HC-Pro与病毒移动有关，在TVMVHC-Pro中插入4个氨基酸导致该病毒不能在植物体内进行系统移动[43]。Rojas（1997）证明HC-Pro可以增加胞间连丝的体积排阻限度（SEL），促进病毒RNA在细胞间的移动[44]，这些研究表明HC-Pro参与了马铃薯Y病毒属病毒的移动。HC-Pro可抑制植物的基因沉默，是一个RNA沉默的抑制子。研究发现表达TEVP1/HC-Pro基因的转基因植株对PVX的侵染特别敏感，反式激活病毒的复制，使PVX的积累量增加，出现PVX和TEV协同侵染时一样的典型症状，增强其致病性，使病毒的危害加重。缺少HC-Pro锌指结构域的TEV突变株与PVX一起也可以引起典型的协生症状，而如果将PVX与HC-Pro中央区域突变了的TEV一起接种，就没有协生作用，从而证明抑制植物的基因沉默过程中起作用的是HC-Pro的中央区域，而不是其氨基端的“锌指结构”[45]。HC-Pro决定蚜传特性且一个特定病毒的HC-Pro能有效地介导其它某些病毒（但不是所有病毒）的传播，表明HC-Pro的蚜传活性有某种程度的专化性[46]。此外Carrington通过一系列的实验证明了HC-Pro的蛋白酶切活性[47]。2.2.2叶片总RNA的提取根据Indirect-ELISA方法鉴定的结果，选取ELISA结果呈阳性的样品，按Trizol方法提取总RNA。（1）器皿和容器的处理：所有待用的烧杯、研钵、试剂、离心管、量筒、枪头、试剂瓶等都用0.1%DEPC水溶液在37℃浸泡24h。然后将能用高压灭菌的试剂、器皿、离心管、枪头等高压灭菌30min，玻璃和陶瓷制品120℃干热烘10-2h。（2）Trizol抽提液提取总RNA方法：步骤1：剪取植株叶片，放在液氮中磨成粉末；步骤2：将粉末转入离心管中，按50-100mg组织：1mLTrizol液的比例加入Trizol抽提液；步骤3：按住管盖用力摇动使其匀浆，室温下放置5min；步骤4：加入200μL的氯仿，盖紧离心管，按住管盖剧烈摇荡15s，于室温放置5min；步骤5：于4℃，12000rpm离心15min；步骤6：取上清液于一新离心管中，加入600μL的异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置10min；步骤7：于4℃，12000rpm离心10min弃去上清液；步骤8：加1mL75%乙醇轻洗RNA沉淀；步骤9：4℃，8000rpm离心5min；步骤10：去上清，室温或真空干燥5-10min；步骤11：溶解在50μLDEPC处理的水中，保存于-76℃，以待使用。2.2.3DNase消化处理（1）用分光光度计测量所提取的RNA的浓度，按照DNase的规格计算各个样品需要加入的体积（各个样品加入的量要一致）；（2）按照DNase给的10μL体系，扩大体系至200μL；（3）加入等体积的酚氯仿抽提一次（酚氯仿，水饱和酚/氯仿=1:1），12000rpm离心10min，取上清至离心管；（4）加入等体积的氯仿抽提一次，12000rpm离心10min；（5）取上清至离心管，加入等体积的异丙醇，混匀后静置30min，12000rpm离心10min，弃上清；（6）用2.5-3倍体积无水乙醇轻洗沉淀；（7）用75%乙醇轻洗两次，晾干，溶于20-30μLDEPC水（75%乙醇用DEPC水来稀释）；（8）用分光光度计测量所纯化的RNA的浓度，用于做RT-PCR。2.2.4cDNA的合成用TIANScriptRTKitTIANScript的反转录试剂盒在M-MuLV逆转录酶作用下合成cDNA第一链。冰上操作（使用DEPC水处理过的Eppendorf管）：（1）在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1-5μg总RNA或50-500ngmRNA；2μLoligo(dT)15或2μLRandom；2μLdNTP(2.5mMeach)；补RNase-freeddH2O定容至13.5μL；（注：加入的各个样品的RNA的量要一致，通过浓度来计算的）（2）70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min。简短离心收集反应液后加入以下各组分：4μL5×First-StrandBuffer；1μL0.1MDTT；0.5μLRnasin；（3）加1μL(200U)TIANScriptM-MLV，轻轻用移液器混匀，如果用随机引物，请将离心管置25℃温浴10min；（4）42℃温浴50min；（5）95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存；如果需要用RNaseH处理，进行步骤6。否则，进行步骤7；（6）加RNaseH1μL(2U)，37℃温浴20min以降解RNA，然后95℃加热5min使酶失活；（7）用RNase-freeddH2O将反应体系稀释到50μL，取2-5μL进行PCR扩增反应。2.2.5PCR技术（1）反应体系取一0.5μLPCR薄壁管，依次加入以下试剂：10×PCR缓冲溶液2.5μLdNTP(10mmol/L)0.5μL正向引物0.5μL反向引物0.5μLTaq酶（5u/μL）0.2μLddH2O20.5μL终体积为25μL，混匀后稍离心，放置PCR仪器中进行PCR反应。（2）反应参数设置步骤1：94℃预变性5min后开始以下循环反应：步骤2：94℃变性45s，步骤3：X℃退火45s，（退火温度因引物的Tm值而变化）步骤4：72℃延伸60s，（延伸时间因目的片段的的大小而变化步骤5：30个循环后72℃延伸10min。2.2.6RT-PCR扩增技术反转录PCR（RT-PCR）的基本原理是以所需检测的病毒RNA为模板，以随机引物、oligo（dT）或基因特异性的引物（GSP）为引物反转录合成cDNA，从而使极微量的病毒核酸扩增上万倍，以便于分析检测。RT-PCR的基本步骤是：首先提取病毒RNA，根据病毒基因序列设计合成引物，反转录合成cDNA，然后进行PCR扩增，取出扩增产物，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。2.3.1PCR产物回收和纯化根据PCR的琼脂糖凝胶电泳扩增结果，在紫外分析仪下用灭菌后的锋利的刀片切下含特异条带的胶条，将胶条转移到1.5mL的离心管中，利用AXYGENBiosciencesExtractionKit从胶中回收目的DNA片段，操作如下：（1）用一干净锋利刀片从凝胶割取目的片段带；（2）加入3倍胶体积的QG缓冲液；（3）50℃10min以熔解凝胶；（4）加入1倍胶体积的异丙醇，混匀；（5）将以上样品转至离心柱，离心柱置于2mL收集管上，14000rpm离心1min；（6）弃去滤过液，加0.5mLQG缓冲液于离心柱中，离心1min；（7）用0.75mLPE缓冲液洗柱，并离心1min，除去滤过液；（8）再离心1次以彻底去除PE缓冲液；（9）加入50μL的10mmol/LTris·HC（lPH8.0）溶解DNA，静置1min后，14000rpm离心1min，收集滤液即为DNA片段溶液，取适量溶液电泳，估计其浓度。2.3.2PCR产物的连接回收的目的基因与克隆载体pGEM-TEasy连接，根据T4DNA连接酶的使用说明书，在连接过程中载体与目的基因的摩尔比为1:1-1:3时可获得较好的连接效果。因此本实验在进行连接反应时设计了载体与目的基因的摩尔比为1:2的反应体系，取上述回收的目的片断与pGEM-TEasy用T4DNA连接酶连接，反应体系如下：PVYHC-ProPCR产物.6μLpGEM-TEasy(50ng/μL).2μL10×T4连接酶缓冲液1μLT4DNA连接酶(3u/μL)1μL终体积为：10μL轻轻混匀，置4℃，反应过夜。2.3.3感受态细胞的制备EcoliTG1感受态细胞的少量制备（CaCl2法）：（1）从大肠杆菌DH5α的培养平板上挑取一个单菌落接于5mLLB液体中培养；（2）以1%的接种量将过夜培养物接种于装有100mL液体培养基（SOB）的三角烧瓶中（即10mL的接种量=100×10%）；（3）37℃振荡培养2-3h（至肉眼可见浑浊，不同菌种摇菌时间有差异）；（4）将菌液转移到7mL离心管（共5支每支放6mL，共30mL）中，冰上放置10min；（5）4℃，4000rpm，离心10min回收细胞；（6）倒出培养液/弃上清，将管倒置1min以便培养液流尽；（7）用冰冷的0.1mol/LCaCl210mL（每个离心管放2mLCaCl2，用枪头轻轻吸上吸下，进行吹打），彻底悬浮沉淀(悬浮后，5个离心管合并成2个离心管，即每管5mL，其余3管丢弃)；（8）立即放在冰上保温30min；（9）4℃，4000rpm，离心10min，弃上清，并倒置使残留液流净，回收细胞（每管先加0.75mL的预冷的CaCl2，2管再合并成1管），再加0.5mL预冷的甘油（甘油终浓度为20%）；（10）戴手套分装细胞(在冰上分装)，每150μL一份，此细胞为感受态细胞，分装后放入盒内，再放入-76℃冰箱保存。2.3.4连接产物的转化（1）取一管液氮保存的感受态细胞，室温融化，置冰上；（2）