毕业设计终稿

JIANGXIAGRICULTURALUNIVERSITY本科毕业论文（设计）题目：青钱柳悬浮培养细胞多糖抑制胰淀粉酶作用研究学院：食品科学与工程学院姓名：段修红学号：20124364专业：食品科学与工程班级：食工1202指导教师：尹忠平职称：副教授二0一六年五月青钱柳悬浮培养细胞多糖抑制胰淀粉酶研究目录摘要....................................................................IAbstract...............................................................II1实验材料与方法.......................................................11.1实验仪器与材料.................................................11.1.1实验仪器..................................................11.1.2实验材料..................................................11.2实验方法.......................................................21.2.1试剂的配制................................................21.2.2青钱柳悬浮细胞多糖的动力学研究............................21.2.2.1葡萄糖的标准曲线的绘制..............................21.2.2.2胰淀粉酶活性测定方法................................31.2.2.3抑制剂下的胰淀粉酶的反应............................31.2.3青钱柳悬浮细胞多糖的荧光猝灭研究..........................31.2.3.1激发波长的确定......................................31.2.3.2荧光猝灭原理........................................32实验结果与分析.......................................................42.1青钱柳悬浮细胞多糖动力学研究..................................42.1.1葡萄糖浓度标准曲线和胰淀粉酶的活性........................42.1.2青钱柳悬浮细胞培养多糖抑制剂下胰淀粉酶的吸光值............52.2青钱柳悬浮细胞荧光猝灭结果与分析...............................72.2.1荧光猝灭的λex............................................72.2.2青钱柳悬浮细胞多糖的荧光猝灭..............................73结论................................................................10参考文献................................................错误!未定义书签。致谢...................................................................13青钱柳悬浮培养细胞多糖抑制胰淀粉酶研究I摘要本文研究了青钱柳悬浮培养细胞多糖抑制胰淀粉酶作用，旨在为青钱柳降血糖作用提供理论基础。先采用动力学方法，通过葡萄糖标准曲线及体外反应模型的建立，随着抑制剂浓度的增大，吸光值减小,青钱柳悬浮细胞多糖Ic50=700mg/ml；然后采用荧光猝灭研究方法，作出的荧光光谱图Stern-Volmer方程分析，青钱柳悬浮细胞多糖的kq大于双分子扩散性猝灭常数值，且伴随着青钱柳悬浮细胞多糖浓度的增加，荧光的强度降低且荧光发射波长（λem）发生蓝移。青钱柳悬浮培养细胞多糖具有抑制胰淀粉酶的抑制能力，其抑制机理是动-静态相联合。关键词：阿卡波糖；青钱柳悬浮细胞培养多糖；胰淀粉酶；酶促反应；荧光猝灭青钱柳悬浮培养细胞多糖抑制胰淀粉酶研究IIAbstractInthispaper,theeffectofPolysaccharidefromthesuspensionculturecellofthegreenwillowwasstudiedinordertoprovidethetheoreticalbasisforthehypoglycemiceffect.Thekineticmethod,throughtheestablishmentofstandardcurveofglucoseandinvitroreactionmodel,withincreasingconcentrationoftheinhibitor,lightabsorptionvaluedecreased,suspensioncellsinCyclocaryapaliuruspolysaccharideIc50=700mg/ml;thenbyfluorescencequenchingmethod,makethefluorescencespectraanalysisofsternVolmerequation,suspensioncellsinCyclocaryapaliuruspolysaccharideKQgreaterthanbimolecularquenchingconstantnumericaldiffusionandwithsuspendedcellsinCyclocaryapaliuruspolysaccharideconcentrationincreased,reducetheintensityofthefluorescenceandfluorescenceemissionwavelength(lambdaEM)blueshift.Thepolysaccharidefromthesuspensionculturecellofthegreenwillowhastheinhibitorycapacityofinhibitingpancreaticamylase.Theinhibitionmechanismisthecombinationofdynamicandstatic.Keywords:acarbose;cellsuspensioncultureofcyclocaryapaliuruspolysaccharide;amylase;enzymaticreaction;fluorescencequenching青钱柳悬浮培养细胞多糖抑制胰淀粉酶研究11实验材料与方法1.1实验仪器与材料1.1.1实验仪器干燥箱:Gpx-9248A,上海跃进医疗器械有限公司；低速离心机：Jw-1042,安徽嘉文仪器装备有限公司；万用电炉：北京科伟永兴仪器公司；循环式真空泵：现义市予华仪器有限公司；低温冷却循环泵：JN032045，宁波新兴生物科技股份有限公司；旋转蒸发器：RE-52AA,上海亚荣生物仪器有限公司；数显恒温搅拌循环水箱：HH-60,宁波新兴生物科技股份有限公司；漩涡混合器：QY-2，上海其特分仪器有限公司;电子天平：AR2140，奥斯豪中国地区；酶标仪：PE21410，北京市现代仪器厂；荧光分光光度计：VARIAN，CARYEclipse，美国；其他：移液器，容量瓶，2ml子弹头若干，小烧杯若干，飘板，量筒，温度计等。1.1.2实验材料与试剂阿卡波糖：江西盛泰化工有限公司，江西。青钱柳悬浮细胞：江西省天然产物与功能性食品重点实验室，江西农业大学。猪胰腺a-淀粉酶：Sigma公司，美国。可溶性淀粉：西陇化工股份有限公司，广东。Nacl（分析纯）:江西化学试剂，江西。乙醇（分析纯）：，国药集团化学试剂有限公司，上海。石油醚：厦门市宏盛化学试剂有限公司，厦门。丙酮：江西盛泰化工有限公司，江西。3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司，上海。NaH2PO4（分析纯）：汕头市西陇化工厂有限公司。NaCl、NaOH（分析纯）：厦门市盛鸿化学试剂有限公司，厦门。乙醇（分析纯）：，汕头市达濠精细化学品有限公司。酒石酸钾钠（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司。实验室用的均为超纯水。青钱柳悬浮培养细胞多糖抑制胰淀粉酶研究21.2实验方法1.2.1试剂的配制（1）生理盐水的制备：用50ml的超纯水，0.2gCacl2和4gNacl配制8%的Nacl的溶液。（2）Tris缓冲液的配制：用25ml1mol/lTris配制和去离子水配制500ml0.05mol/l的Tris缓冲液。（3）淀粉的配制：用0.4g的淀粉和100ml的Tris的缓冲液配制1mg/ml的淀粉溶液。（4）酒石酸钾钠溶液：取12g的四水酒石酸钾钠，溶解于8ml的2MNaOH溶液中。磁力搅拌器搅拌，加热，不要沸腾。（5）96mM/L3，5-二硝基水杨酸试剂溶液：用20mL去离子水溶解，磁力搅拌器搅拌，加热，不要沸腾。（6）DNS显色试剂溶液：把试剂（3）缓慢的加入试剂（4）中，搅拌。用去离子水稀释到40mL。室温下溶液储存在棕色试剂瓶中。（7）青钱柳悬浮细胞培养多糖[6]的制备：研磨青钱柳悬浮细胞至粉末，称取4g悬浮细胞，加入120ml的蒸馏水，浸提24h，放入3000r/min离心机中离心5min，取上清液于旋蒸器80℃下浓缩10倍，量取溶液的体积，加入145ml的95%的乙醇，放入冰箱中静置24h，离心取沉淀，分别加入无水乙醇离心，留下沉淀；丙酮离心，留下沉淀；石油醚离心，留下沉淀。定容加入5ml超纯水。配制成功800mg/ml的青钱柳悬浮细胞培养多糖[7]标液。取上述配制好的青钱柳悬浮细胞培养多糖标液，分别制取20,40,80，160,320,640,800mg/ml.（8）胰淀粉酶标液的制备：称取7.8mg的淀粉酶加入5ml的生理盐水，在37.5的恒温箱中一边振荡，一边孵育30min,最后在3000r/min的离心机离心5min，上清液即为1.56mg/ml的淀粉酶标液。取标液配制0.195、0.39、0.585、0.78、1.17、1.56、3.9、7.8、15.6mglml（9）阿卡波糖[20]标液的制备：称取7.5mg阿卡波糖与5mlTris缓冲液混合，配成了1.28mg/ml的阿卡波糖标液。（10）100mg/ml葡萄糖的标液：将100mg葡萄糖溶解于1ml超纯水。1.2.2青钱柳悬浮细胞多糖的动力学研究1.2.2.1葡萄糖的标准曲线的绘制如表（1-1）所示，分别取葡萄糖的标液0，50,100,150,200,250，300ul于7个2ml的子弹头中，加入超纯水至总体积为600ul(空白对照组为600ul的超纯水)，青钱柳悬浮培养细胞多糖抑制胰淀粉酶研究3与400ul的DNS，摇匀，沸水加热5min,取出，然后在冰水上冷却至室温，然后取100ul的反应后的溶液和100ul的超纯水于96板中，混合后在37C，波长在540nm出测量标准实验组和空白对照组的吸光值，绘制不同浓度的葡萄糖与吸光度的关系图。实验组三个样。1.2.2.2胰淀粉酶活性测定方法按上述方法配制1.56mg/ml淀粉酶溶液，采用DNS显色法，测定淀粉酶的活性。从上述绘制的葡萄糖浓度标准曲线中计算反应生成葡萄糖的量。淀粉酶的酶活力单位为：在37℃，10min内从1%淀粉中分解出1mg葡萄糖的淀粉酶量为一个活力单位。1.2.2.3阿卡波糖和青钱柳悬浮细胞培养多糖有抑制剂下的胰淀粉酶的