渗析技术在离子色谱法测定蔬菜亚硝酸盐和硝酸盐中的应用

渗析技术在离子色谱法测定蔬菜亚硝酸盐和硝酸盐中的应用徐霞应兴华(中国水稻研究所，杭州310006，E-mail:[e-mail])摘要：建立了膜渗析与离子色谱联用技术分析蔬菜等复杂基体中亚硝酸盐和硝酸盐的新方法。蔬菜样品经沸水浴后，试样液通过膜渗析除去水溶性大分子杂质和颗粒，直接进入离子色谱分析。渗析池采用孔径0.20μm的醋酸纤维为渗析膜，以水为接收液，分析柱为MetrosepASupp4-250阴离子交换柱，以1.8mmol/LNa2CO3+1.7mmol/LNaHCO3为流动相，采用化学抑制电导检测。以20g称样量计，方法中NO2ˉ、NO3ˉ的检出限分别为0.075mg/kg和0.105mg/kg，实际样品的加标回收率分别为80%，相对标准偏差(RSD)≤10%。关键词：渗析，离子色谱，蔬菜，亚硝酸盐，硝酸盐1引言硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于人类环境中，亚硝酸盐可与次级胺(仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸)结合，形成亚硝胺，诱发消化系统癌变[1,2]；硝酸盐在细菌的作用下可还原成亚硝酸盐，使血液的载氧能力下降，导致高铁血红蛋白症。因此，过量摄入硝酸盐和亚硝酸盐不利于人体的健康。已有调查发现，人体摄入的硝酸盐和亚硝酸盐大部分都来自日常食用的各类蔬菜[2]。蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量的高低已成为衡量其食品安全与否的一项重要指标。硝酸盐和亚硝酸盐的分析方法众多，其中以离子色谱法为众分析方法之首选[3]。然而蔬菜的基体较为复杂，其中的水溶性杂质不仅会严重干扰目标化合物的测定，且高负载的样品还会损坏色谱柱或堵塞流路、泵甚至检测器。目前应用较广的离子色谱样品净化技术主要有稀释、过滤、超滤和固相萃取法等[4-6]，但上述技术通常采用手工完成，精密度和准确度低，且费时费力。Nordmeyer等[7]首次采用渗析作为离子色谱的样品制备技术。目前，国内外已有较多关于渗析和色谱联用技术的相关报道，但尚未见将渗析技术用于蔬菜样品前处理的相关报道。因此，本实验采用了膜渗析和离子色谱联用技术测定蔬菜中的硝酸盐和亚硝酸盐含量，通过优化渗析和色谱条件，测定了各类蔬菜中的硝酸盐和亚硝酸盐。2实验部分2.1仪器与试剂MetrohmMIC离子色谱仪(瑞士万通公司)配有819型电导检测器、833型MSM化学抑制器、838型自动进样装置、833型膜渗析单元和ICNet2.3色谱工作站；T-25型高速组织捣碎机(德国IKA)；Milli-Q纯水器(美国Millipore)。NO2ˉ标准物质GSB05-1142-2000购自国家环境保护总局标准样品研究所，NO3ˉ标准物质GBW(E)080264购自国家标准物质研究中心，其余试剂均为分析纯。所有测定用新鲜蔬菜购自当地超市或农贸市场，分析和测定用水均为电阻率为18.2MΩ·cm的去离子水。2.2样品预处理将新鲜蔬菜样品用自来水洗净，再用去离子水冲洗2~3次，晾去表面水分。用四分法取可食部分，切碎，按比例加入一定量水(称取试样时应扣除加水量)，用高速组织捣碎机制成匀浆样品。称取5~20g(精确到0.001g)匀浆试样于150mL具塞磨口锥形瓶中，加入70~80℃水100mL，沸水浴15min，待溶液冷却后转移至200mL容量瓶，定容，静置，取上层液待测。中国色谱网色谱条件色谱柱：MetrohmASupp4-250阴离子交换柱(250mm×4mm)配有MetrohmASupp4/5保护柱；淋洗液：1.8mmol/LNa2CO3+1.7mmol/LNaHCO3；流速：0.7mL/min；再生液：100mmol/LH2SO4；柱温：室温；进样体积：20μL。2.3.2渗析条件渗析膜(孔径:0.2μm，直径:47mm，厚度：115μm)，渗析池为有机玻璃(池体积：240μL)，采用双通道蠕动泵(转速：20/24r·minˉ)。停留渗析时间为10min，转移时间为0.4min。2.4样品分析采用两种方法对蔬菜中的NO2ˉ和NO3ˉ定性：在相同的色谱条件下，将样品的色谱图与标准溶液的色谱图对照，根据色谱峰的保留时间确定；在样品中加入NO2ˉ和NO3ˉ的标准溶液，根据峰高的突增进一步验证色谱峰的归属。采用峰面积外标法定量。图1为硝酸根、亚硝酸根及其它阴离子标准溶液的色谱图。图2为洋葱鲜样及其加标后的叠加色谱图。3结果与讨论3.1膜渗析的特性及其分离选择性经“2.2”处理后的蔬菜样品待测水溶液中存在多种分子和离子化合物，如色素、淀粉、各类糖、植物蛋白和有机酸等。对于抑制电导离子色谱分析的干扰而言，可以通过选择合适的色谱柱，调节淋洗液的组成、比例和流速等色谱条件的优化排除离子化合物对目标化合物的干扰，例如，蔬菜中的各类有机酸和阴阳离子等。然而，一些分子量较大的化合物一旦进入色谱柱，则较难被洗脱下来，从而引起柱效下降等一系列问题。而渗析是基于离子和分子经半透膜迁移的分离方法，其中被动渗析选择性分离的特征就是分子量切割(MWCO)，即道尔顿理论。文中采用渗析膜的分离限制步骤在100~500千道尔顿范围内，可以排除淀粉、色素等分子量较大的化合物，但对于黄酮等小分子量的化合物的净化作用并不明显。3.2膜渗析的条件选择渗析分离的选择性不仅仅由MWCO值决定，还取决于动态情况下渗析的时间和离子在液相和膜中的迁移率。实验采用NO2ˉ和NO3ˉ的标准溶液优化停留渗析和转移时间，并通过比较直接进样和渗析进样的标准溶液的峰面积验证渗析效率。图3和图4为停留渗析时间和转移时间对待测离子峰面积的影响。经过优化，本实验选定停留渗析时间为10min，转移时间为0.4min，渗析效率高于98%。由于蔬菜样品基质较复杂，一般分析50次蔬菜样品后需更换一次渗析膜，以保证实验的渗析效率。3.3工作曲线、线性范围与检出限在“2.3”实验条件下，对NO2ˉ和NO3ˉ进行线性关系实验并测定检出限，结果见表1。3.4精密度和回收率将同一样品菠菜在短时间内连续测定11次，其中NO2.和NO3.的相对标准偏差分别为6.1%和2.9%。在3种不同种类的蔬菜样品中添加不同含量的2个水平的NO2.和NO3.混合标准溶液，按照步骤进行回收率实验，结果见表2。3.5小结在各类新鲜蔬菜中，除香椿的亚硝酸盐含量较高外，其余新鲜蔬菜中均不含亚硝酸盐或含量较低。叶菜类、根茎类的蔬菜中硝酸盐含量较高，云薹属类、茄果类等蔬菜中硝酸盐含量则依次降低。参考文献[1]CorreWJ,BreimerT,Nitrateandnitriteinvegetable,Wageningen:CenterforAgriculturalPublishinganddocumentation.,1979,85~86[2]GangolliSD,BrandtPA,FeronVJ,JanzowskyC,KoemanJH,SpeijersGJA,SpiegelhalderB.EnvironmentalToxicologyandPharmacology,1994,292:1~38[3]MouShifeng(牟世芬),LiuKena(刘克纳).Applicationofionchromatography(离子色谱方法及应用).Beijing(北京):ChemicalIndustryPress(化学工业出版社),2001:270~272[4]SiuDC,HenshallA.J.Chromatogr.A,1998,804:157~160[5]ZhouMeisu(周梅素)，GuoDonglong(郭东龙).ChineseJournalofAnalyticalChemistry(分析化学)，2000，28(8):1056[6]XuXia(徐霞)，YingXinghua(应兴华)，ChenNeng(陈能)，DuanBinwu(段彬伍).EnvironmentalChemistry(环境化学)，2005，24(6)：733~734[7]NordmeyerFR,HansenLD.Anal.Chem.,1982,54:2605~2607[8]AOAC.OfficialmethodsofanalysisoftheAssociationofOfficialAnalyticalChemists.Philadelphia,15thed.,1990,Section973.31