抗菌实验方法

一、抗菌实验字体[大][中][小](一)体外抗菌实验1.实验前的准备工作(1)培养基的准备：肉汤琼脂培养基、真菌琼脂培养基等均可按药典规定的方法配制。(2)药液的准备：一般采用中草药水煎液，经滤过浓缩成1：10～1：1的浓度，试验前的药液需灭菌，以免污染影响结果。(3)试验菌株的选择及制备：一般使用典型的菌株，或从临床分离经鉴定后取得的菌株，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、链球菌、肺炎双球菌、白色念珠菌、酵母菌及真菌等。细菌菌液的制备：将斜面菌种接种于普通肉汤培养基中，肺炎双球菌及溶血性链球菌须在上述培养基中加入5%～10%血清，或加入25%(V/V)或20%猪血水，37℃培养6～8小时或16～18小时。真菌菌液的制备：将菌种接种于大试管中，并在22℃～25℃培养24小时或7天(视菌种及生长速度而定)，然后用灭菌生理盐水10mL洗脱制成混悬液。菌液的浓度一般先采用培养液，如不显示抗菌作用，可再稀释成一定浓度。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌可用1：1000浓度，肺炎双球菌、溶血性链球菌、白色念珠菌、酵母菌可用1：10或1：100浓度。2.实验方法(1)平碟法：取熔化后的培养基，每平碟(培养皿)倒入15mL，待凝固后，在培养基表面划线接种试验菌株，在划线的中间位置安放一个灭菌的不锈钢圈，在圈内滴入试验药液。也可采用打洞法，即在凝固的培养基上用已灭菌的打孔器打孔挖去琼脂块，将药液滴在洞内。用灭菌陶盖盖好，细菌在37℃、真菌在22℃～25℃培养18～20小时，观察细菌生长情况，如全线生长则认为该浓度的药液无抗菌作用，如细菌或真菌划线为药液所切断，则认为该浓度药液有抗菌作用。(2)平碟稀释法：先将中药药液2mL加入平碟内，再加入已溶化的培养基8mL，充分摇匀，待凝固后，划线接种菌株，同时用水2mL代替药液制作空白对照平碟，方法同样，接种后，将平碟倒置，在37℃(真菌在22℃～25℃)培养18～20小时，观察结果。如对照碟长菌、药液碟不长菌，则认为有抗菌作用。(3)试管法：取试管12支，在每一试管中加入培养基5mL，于第1管中加被试药液5mL，混合均匀，吸出5mL加到第2管中，混合均匀，再吸5mL加到第3管中，依次操作，直到第10管，将第10管混合均匀后吸出5mL弃去，其药液稀释依次为1：2，1：4，1：8，……1：1024，再于前11管中各加入适当浓度的菌液0.1mL，第11管作为菌液对照，第12管不加菌液，加被试药液0.1mL，作为药液对照。将其全部在37℃(真菌22℃～25℃)培养16～24小时(真菌24～72小时)，观察各管菌株生长情况。如菌液对照管浑浊，表示菌株生长良好;药液对照管澄明，表示药液没有染菌。再将试验管与对照管比较，以溶液澄明无菌生长为有抗菌作用，其中以药液稀释度最大管的药液浓度为最小抗菌浓度。如欲了解药液的抗菌作用是抑菌（MIC）还是杀菌（MBC），可将上述不长菌试管中的溶液，用接种环转种到肉汤培养基中，经37℃培养16～20小时(真菌则在22℃～25℃培养24～72小时)，如仍不长菌，表示药液有杀菌作用。(？)(二)动物体内抗菌实验1.实验前的准备工作(1)菌液的制备：将选定的菌种，用接种环从斜面培养基上接种于肉汤培养基中，在37℃培养18小时后，再用培养基转种一次，培养18小时后，取出备用。将上述菌液用生理盐水按10倍顺序稀释成不同浓度，每一浓度菌液分别注射给5只小白鼠，观察4天，以能使80%～100%小鼠感染死亡的菌液供正式实验用。(2)药物的配制及选择剂量：先将药物配成一定浓度的溶液，再用二倍稀释法配成三种浓度的溶液，通过动物毒性预试，确定其半数致死量和最大耐受量。以LD50的1/3～1/5或最大耐受量的1/2为实验治疗剂量的起点，可再选2～3个剂量，同时分组实验。例如某药物的LD50药为500mg/kg，则实验治疗剂量可选用100、50、25mg/kg三个剂量。2.实验治疗(1)小鼠腹腔感染：取小鼠分4组，每组10只(体重17～20g)，一组给生理盐水做对照，其他组分别给几种浓度的药液，1小时后，各组小鼠均腹腔注射适当稀释的菌液0.5mL，感染后1小时及6小时，必要时在24小时再给药液或生理盐水1次，观察4天，记录各组小鼠死亡的时间和死亡率。(2)小鼠静脉感染：取小鼠分为5组，每组10只，一组为生理盐水对照，一组为已知药物对照，其余三组为实验药物组，各组小鼠由尾静脉注射适当稀释的菌液0.2mL，然后每天给药2次，共给7天，观察3周，记录各组小鼠死亡数，计算死亡率。实验结果分析在腹腔或静脉感染时，如果对照组死亡率达80%～100%，实验组死亡率比对照组少25%以上，表示该药有抗菌作用;如实验组与对照组死亡率相近似，说明该药在现用剂量下无抗菌作用，可适当增加剂量重试;如实验组死亡率大于对照组，且死亡时间也快，说明药物的毒性影响疗效观察，应适当降低药物剂量后再试;如对照组死亡率低于50%，表示感染菌株毒力太小，应增加感染菌液量或另选毒力大的菌株。，将装入试管内的称为“斜面琼脂培养基”，一般用于菌种的培养或保藏；将装入锥形烧瓶或培养皿内的称为“平板琼脂培养基”，多用于菌种分离。培养皿倒放，可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下，冲散菌落。