林木组织培养

一、植物组织培养在农林业生产上的主要应用。在现代农林业生产中植物组织培养主要应用于以下几个方面：1.植物组织培养在离体快速繁殖上的应用。植物离体快繁也叫微型繁殖，是目前植物组织培养中应用最广泛、最有成效的一种技术。植物组织培养不受地区、气候变化的影响，培养条件可以人为控制，其繁殖速度快，一般比常规繁殖方法快万倍到数十万倍，为快速获得农作物和园林苗木提供了一种新的途径。植物离体快繁主要应用于新育成、新引进、新发现的良种的快繁；无病毒苗的大量快繁及一些特殊材料如育种材料、突变体、基因工程植株、濒危植物等的快繁。一些无性繁殖作物如果树、球茎和鳞茎植物、马铃薯、甘薯、菊花、草莓等，生产中所用的品种一般为杂合型的植株，这类植物如采用种子繁殖，则后代会出现变异，不能保持原品种的优良特性；采用常规无性繁殖，不仅有些类型的植物繁殖率低，而且长期多代繁殖后，因病虫害等原因会使种性下降。因此对这些无性繁殖的作物来说，组织培养的繁殖方法无论是对加快繁殖还是对提高种性来讲都是十分适宜的。目前世界上80％~85％是通过组织培养进行脱毒和快繁的。目前我国为其他国家代加工生产或直接出口的组培苗品种有甘蔗、香蕉、百合、玉簪、大花萱草、唐菖蒲、丝石竹等近30种。2.培育无病毒苗。许多植物都遭受到病毒病不同程度的危害。有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，严重地影响了产品的商品价值。对于无性繁殖的作物如绝大部分的果树、部分蔬菜（洋葱、大蒜、石刁柏、菊芋、马铃薯）和花卉（菊花、唐菖蒲、风信子、秋海棠、月季）等，如遭受病毒侵染后，代代相传，则体内可以积累相当高浓度的病毒，影响生长和成活，严重危害生产的发展。而病毒病又不同于真菌和细菌病害，采用杀菌剂和抗生素等化学药剂防止很难凑效。自从Morel（1952）发现采用茎尖培养的方法可以从严重感染病毒的植株得到无病毒苗后，这方面的工作引起了人们的重视。在许多园艺植物上进行培育试验也相继得到成功，从此茎尖培养就成为解决病毒病害的一个重要途径。也可以采用茎尖培养与热处理相结合的方法来提高茎尖培养的脱毒效果。对于一些木本果树植物，如果茎尖培养得到的植株难以发根生长，且结果晚，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培养无病毒苗。利用组织培养生产无病毒苗的方法，已在许多果树（柑橘、苹果、草莓、葡萄）、蔬菜（马铃薯、大蒜）、花卉（兰花、菊花、康乃馨、水仙、唐菖蒲）等作物的常规生产上得到应用。目前中国已建成葡萄、苹果、香蕉、马铃薯、甘蔗等作物脱毒快繁生产线11条。3.植物组织培养在育种上的应用。1964年，印度的Guha和Maheshwari在毛叶曼陀罗花药培养中，成功地由花粉诱导得到了单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究，以后在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、甜椒、草莓、苹果等多种植物上获得成功。利用花药和花粉培养诱导花粉发育成单倍体植株，单倍体植株经过秋水仙素等药剂处理后，染色体加倍可以获得同源二倍体的纯合系，其后代不会分离，可以直接用于选育杂种一代的亲本或性状纯合的常规品种。在远缘杂交中，杂种胚经常停止发育，得不到杂种植株，而通过胚胎培养则可以克服远缘杂交的这种困难。这种方法在育种实践中早已被采用。如在普通栽培番茄与野生番茄—秘鲁番茄的远缘杂交中就常被采用。在组织培养中能够产生突变，突变的产生因部位而异。茎尖的遗传性比较稳定；细胞和组织在培养中变异率较大。采用紫外线等射线照射培养物，或者在培养基中加入叠氮化合物，可以诱导和提高突变率。如我国已经筛选出耐盐的水稻、烟草、甘蔗的再生植株或细胞系。20世纪70年代初，日本科学家首次利用烟草叶片分离出的原生质体培养获得再生植株成功。日本和中国在原生质体培养领域做出了重要贡献。中国成功地培养了包括大豆、玉米、小麦、高粱等重要作物在内的30个以上品种的原生质体再生植株。4.人工种子。人工种子的概念是1978年提出的，它是指最外面的一层有机的薄膜包裹以及保护水分免于丧失及防止外部的物理力量冲击，中间含有培养物（胚状体、腋芽或不定芽等）所需要的营养成分和某些植物激素，是作为胚状体等萌发时的能量和刺激因素，最内则是被包埋的胚状体或芽。通过这几部分的组合，以人为的方法制造出一种和天然种子类似的结构。1958年Reinert在胡萝卜的组织培养中最先发现了胚状体（即体细胞胚胎），之后，在至少100余种植物的组织培养中产生了胚状体。从20世纪80年代起，人工种子的研究在世界上受到广泛的关注。美、日、法等国相继开展了人工种子的研究，并在胡萝卜、苜蓿、芹菜、花椰菜、莴苣和花旗松等植物上获得了初步成功。中国也从“七五”开始研究人工种子。5.植物种质资源的保存与交换。由于许多植物的组织和细胞培养物在液氮超低温条件下贮藏后，仍然能够保持很高的存活率并能重新再生出植株，保持原来的遗传特性，因此可以利用植物组织培养技术保存植物种质资源，从而节省了大量的人力和土地资源。将植物材料以组培形式保存在容器内运输，开展国家、地区间的种质资源交换和植物商品交流，不仅能够节省时间和空间，降低运输成本，而且能够减少种子和非试管植株材料所携带的有害生物的危险。设在秘鲁首都利马的国际马铃薯中心已对14个国家以组培形式运输，以后，甘蔗、姜、甘薯及多种花卉在国家间也采用了组培形式进行商品交流。二、植物组织培养中常见的问题及其对策。在植物初代培养和继代培养过程中经常会遇到一些问题,如污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等,影响实验结果,甚至导致实验失败,给科研和生产造成损失。对这几个问题产生的原因及解决措施进行了论述。1.污染。污染是在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌,导致培养失败。造成污染的原因有多种,培养环境不清洁,母株预处理不当,外植体灭菌不净,培养基受菌污染,实验所用仪器消毒不彻底,操作程序不当等都会造成污染。细菌污染的主要特征是培养材料周围出现粘液菌斑或培养基中出现混浊雾状痕迹,主要由外植体、操作器具、培养基灭菌不严引起。真菌污染的特征是菌斑呈绒毛状、絮状,有不同颜色的孢子,多由如操作不慎真菌孢子从瓶口落入造成污染。另外还有内生菌造成的潜伏性污染。解决办法：①严格消毒,规范操作程序。接种室、超净工作台、培养室要定期消毒,培养室相对湿度控制在70%左右。室内污染源主要是空气中的真菌和细菌,可用75%的酒精室内喷雾,也可用高锰酸钾和甲醛混合熏蒸。接种前用70%的酒精擦洗超净工作台,并且打开紫外线灯照射30分钟,保证超净工作台处于无菌状态。严格无菌操作,接种工具全部消毒,接种人员自身要全面消毒等。每次操作都要用酒精灯烧烤接种针,在操作过程中,尽量不说话,头部不要伸入操作台内,快速完成接种过程。②外植体和培养基的灭菌。在组织培养过程中,选择不易污染且易表达全能性的外植体是成功建立组织培养体系的决定因素之一,所取外植体材料为较幼嫩的茎、叶时,可先将材料用清水冲洗干净,用吸水纸吸干,再以70%的酒精浸泡,无菌水冲洗后,用2%~10%的次氯酸钠浸泡。2.褐变。影响褐变因素有很多,因植物品种、基因型、外植体的取材部位及生理状态、材料的年龄和大小、光照、温度等环境条件的影响,褐变程度差异较大。单宁、色素含量高的木本植物易发生褐变,像板栗、核桃因单宁含量高,在初代、继代培养中极易发生褐变而死亡。像块茎、鳞茎类、天南星科、松柏科、木兰科、茶科植物很易褐化。蔷薇科、金缕科,木犀科植物等不易褐化。幼龄材料褐变率较低,冬春季节褐变较轻,而夏季褐变较重。温度过高或光照较强会促进酚类物质的氧化,加速褐变。有些植物如菊的茎段虽然易褐化,但并不影响愈伤组织或丛生芽的诱导,可不考虑褐化因素。当褐化严重影响了愈伤组织和芽的诱导时,就要采取措施抑制褐变。解决办法：选用适宜的外植体、控制培养条件以及选择幼龄材料作为外植体,褐变较轻。外植体受伤害程度直接影响褐变,切割时尽可能减小伤口面积,并缩短切口暴露在空气中的时间。笔者在试验中发现切口长度以8~14mm褐变较轻,成活率达85%。选择合适的消毒剂和消毒方法,增加琼脂的用量使培养基的硬度增大,降低了酚类物质的扩散速度,褐变减少。初期培养要在黑暗和弱光下进行。降低温度,暗处理母株,连续转移几次,可减少外植体发生褐变。3.黄化。培养基中矿物质营养不均衡、铁含量不足、激素配比不当、糖不足、长期不转移、培养环境通气不良、pH值大、光照不足、培养温度不适等,是整株失绿、全部或部分叶片黄化的主要原因。解决办法：①)配制母液和培养基的制作过程中,要检查仪器设备是否准确,还要认真细致地核对每项称量的每一个环节；②配制培养基时切记不要忘记加糖；③及时转接培养物；④使用透气的封口膜以改善瓶内通气状况；⑤适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度；⑥控制培养室内的温度;适当增加光照；⑦在培养基中添加抗生素类物质如青霉素、链霉素、头孢霉素等,有时也会出现幼苗黄化现象,应适当减少用量或停止使用。4.畸形胚。体细胞胚胎在早期发育时出现畸形,形态和生理功能都出现异常,不能育成苗,或移栽不能成活的现象叫畸形胚,如联体胚、子叶畸形胚、单极胚、多极胚、无极胚、胚轴畸形胚、重新愈伤化胚、玻璃化胚、白化胚等。越靠近子叶片,畸形胚分化率越高,子叶片上的不定胚几乎都是畸形胚。解决办法：在体胚发育早期,培养基中加入适当浓度的ABA、NAA、KT,子叶畸形胚、多极胚和其他畸形较轻的胚状体可在畸形胚的基础上长出正常芽,逐渐发育成正常苗。当KT使用浓度为0.5mg/L时,最有利于畸形胚萌发转化为正常苗,转化率可达37.5%。增加蔗糖浓度或直接干燥减少水分,缩短胚性愈伤组织诱导培养时间,减少种植密度,选择通风透光条件好的培养器,都可减少畸形胚的发生。5.玻璃苗。植物组织培养中,出现试管苗含水量高,嫩梢呈半透明状,叶片皱缩卷曲,植株矮小失绿,叶表无角质层腊质,组织结构发育畸形的现象,这时的试管苗称为玻璃苗。玻璃苗生根困难,移栽后不易成活,不能继续培养。玻璃苗多为组培过程中措施不当造成的非遗传生理性失调症状,进行适当的恢复培养,多数可恢复正常生长。培养基中离子种类,比例不适,琼脂浓度低,培养环境如温度、光照、湿度、pH值、通气不良等间接影响玻璃苗的发生。解决办法：①选择不易玻璃化的基因型材料及部位作为外植体。②选择适当培养基、糖源及外源激素的种类和浓度,提高培养基中Ca2+、Zn2+等离子浓度,适当提高琼脂用量。③降低培养基的衬质势,减少培养基中植物材料可获得的水分。④适当提高培养基中蔗糖含量,降低培养器内部环境的相对温度。⑤改善培养容器的通风换气条件,使用透气性好的容器或封口材料如用棉塞封口等都可减少玻璃苗的发生。三、植物微体快速繁殖主要技术环节。植物快繁与脱毒生产的技术环节包括培养基制备、器具消毒、外植体选择、接种和初级培养、继代增殖培养、壮苗、生根、驯化和移栽、种苗生产计划与成本预算等。培养基选配、外植体选取、试管苗驯化与移栽、种苗生产计划与成本预算是4项主要技术。1.培养基的选配。种植物能否通过组织培养进行大量、快速的繁殖，关键在于设计和选用合适的培养基，使每个分生组织细胞或脱分化的体细胞能够持续生长并适时分化。MS培养基是快繁与脱毒培养中应用最广泛的培养基，它的特点是无机盐的浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大。同时还含有一定数量的铵盐，这使得它营养丰富，不需要添加更多的有机附加物，就能满足植物组织对矿质营养的要求，有加速愈伤组织和培养物生长的作用，即使培养物久不转移，仍可维持其生存，所以它是大多数植物的培养基。与MS比较类似的有LS、BL、ER培养基。B5、N6和SH等为硝酸盐含量较高的培养基，H、Nitsch、Miller和Blaydes培养基为中等无机盐培养基。植物生长调节物质对愈伤组织诱导、器官分化及植株再生具有重要的作用，常常是培养基中不可缺少的的关键物质。植物生长调节物质包括生长素和细胞分裂素。生长素的主要作用是诱导愈伤组织的产生促进细胞脱分化，促进细胞的伸长生长，诱导受伤的组织表面形成愈伤组织，促进生根。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和ABT生根粉等。2.外植体的选取。快