实验室猪精液检查及人工授精技术

猪精液质量安全与实验室关键技术•Tel:[phone]mail:[e-mail]2012-06-05中国农业大学动物科技学院朱士恩汇报提纲猪精液的特性及精子结构精液体外保存及操作安全实验室精子质量检测方法精子指标与受精能力的关系人工授精新方法及操作安全猪精液的特性及精子结构猪精液的特性猪精子结构猪精液的特性射精量300~600亿平均2亿/mL乳白色略带腥味密度颜色气味初：7.0~7.8，浓密：弱碱性pH值150~500mL精子数活率50~80%头部颈部尾部猪精子结构猪的精子分头部、颈部和尾部三个主要部分。长度为50～60μm，表面有质膜，是含有遗传物质并有活动能力的雄性配子。头部大小：猪精子头部长8.5μm；形状：为扁卵圆形，长:宽:厚=8:4:1；质膜：精子头部最外层的膜；细胞核：内含遗传物质DNA；顶体：在质膜下为帽状双层结构的顶体，顶体内含多种与受精有关的酶。侧面注意渗透压，保证脂膜完整性颈部位置：猪精子的颈部位于头的基部，是头和尾的连接部；作用：精子尾部的纤丝在该部与头相连接。1.小头2.植入板3.中心粒4.核膜瘤5.中段起始部注意断颈尾部作用：为精子最长的部分，是精子代谢和运动器官；组成：根据其结构的不同又分为中段（约10μm）、主段（约30μm）和末段（约2~5μm）；中段：由颈部延伸而来，内有线粒体，是精子分解营养物质和产生能量（ATP）的主要部分。1.质膜2.线粒螺旋体3.线粒螺旋体横切4.外周纤丝5.中心纤丝6.终环后窝7.终环8.植入板9.质膜10.外圈纤丝11.内圈纤丝12.中心纤丝畸形精子和分类头部畸形尾部畸形中段畸形种类：窄头、头基部狭窄、梨形头、圆头、巨头、小头、头基部过宽和发育不全等。形成位置：精子在睾丸内精子发生过程中受不良环境影响引起的。种类：包括中段肿胀，纤丝裸露和中段呈螺旋状扭曲等。形成位置：中段畸形多数是在睾丸或附睾发生。种类：尾部各种形式的卷曲、头尾分离、双尾、带有原生质滴的不成熟精子。形成位置：精子通过附睾、尿生殖道和体外处理过程中出现的。精液检测宏观指标：颜色、气味、pH、体积、密度、活力、活率等；微观指标：质膜完整性、线粒体、顶体和获能状态等。精子质量检测方法精子运动能力检测精子密度检测精子畸形率检测精子质膜完整性检测颜色、气味、pH、采精量检测获能和顶体检测染色质完整性检测透明带结合检测体外受精检测线粒体功能检测67891012345颜色、气味、pH、采精量检测颜色乳白色或浅灰色绿色、黄色浅红色、红褐色气味略带腥味恶臭等异常气味pH值正常精液pH值初:7.0~7.8；浓密:弱酸性pH值越低精子密度越大采精量电子天平称量法按1g=1mL计射精量为150~500mL正常正常异常异常精子运动能力检测显微镜检测目测估测法检测活率按0.1~1.0的十级评分法进行评估目测估测法活率要求鲜精活率＞0.7才可进行稀释配制保存精液活率＞0.6才可以使用计算机辅助（CASA）检测精子运动能力活力轨迹速度（VCL）平均路径速度（VAP）直线运动速度（VSL）直线性（LIN）活率CASABreedBoars(n)Ejaculates(n)PMI(%)1Motile(%)2Linearlymotile(%)VSL(μm/s)3VAP(μm/s)4VCL(μm/s)5LHD(μm/s)6L186660±8.353±4.560±11.884±11.296±12.7136±17.13.1±0.52Y206660±8.452±6.066±12.785±11.595±12.5131±17.22.9±0.63H92360±5.449±4.669±12.984±10.494±10.5123±19.02.5±0.71Table2解冻后质膜完整率和活力参数(fromEriksson,2002)H，汉普夏;L,长白猪;Y，约克夏.1精子质膜完整率；2眼观评估；3直线运动速度；4平均路径速度；5轨迹速度；6精子侧摆幅度计算机辅助分析仪直线运动有活动力运动较慢靠近边缘精子密度检测估测法精子密度仪法和CASA法血细胞计数法主观性强，误差大＜一个精子为“密”＝一个精子为“中”＞一个精子为“稀”最准确，但速度慢滴上1滴稀释精液原精液200μL3%NaCl稀释10倍计数板上放盖玻片计数5个中方格精子将该数乘以50万方便、时间短、重复性好猪精子密度为平均2亿/mL生产上主要以精子密度仪法检测精子畸形率检测取中层精液抹片固定液固定20minGiemsa染色90min水洗并风干置1000倍油镜下观察精子＞300个畸形率检查方法相差显微镜直接观察伊红或姬姆萨等染色后普通显微镜观察畸形率要求染色后显微镜观查影响：畸形率过高会减少精液的受精能力要求：不超过18%为宜改善：增加精液的用量可以提高其受精效果精子质膜完整性检测精子质膜染料分类精子不同区域质膜的检测精子质膜的主要检测方法精子质膜作用及分布1234流式细胞仪精子质膜作用及分布维持完整的细胞内环境受精过程中起到信号识别与传导作用转运物质功能覆盖于顶体外膜区上的质膜覆盖于精子头部非顶体区的质膜覆盖于尾部的中段和主段部分的质膜作用分布精子质膜染色原理：此种染料不能进入质膜完整功能的精子内部，只能进入质膜受损的精子，并与DNA结合发出荧光。染色原理：活精子特异的荧光染料是膜通透性的染料，只能进入细胞膜完整的精子。SYBR-14烟酸己可碱33342羧基荧光素双醋酸盐(CFDA)荧光染料死精子特异性荧光染料活精子特异性荧光染料非荧光染料伊红—苯胺黑染色伊红—苯胺蓝染色苔盼兰—吉姆萨染色碘化丙锭（PI）Hoechst33258溴化乙锭（EB）精子质膜染料分类精子不同区域质膜的检测覆盖于顶体外膜区上的质膜覆盖于精子头部非顶体区的质膜覆盖于尾部的质膜荧光染料，如碘化丙锭（PI）、溴化乙锭（EB）、DAPI、Hoechst33258等非荧光染料，如伊红—苯胺黑、伊红—苯胺蓝等精子的低渗肿胀实验（HOST）检测通常与顶体外膜完整性的检测联合起来进行原理：低渗溶液中，有生物活性的精子质膜会使水分子进入质膜中，水的内流使精子尾部的质膜膨胀并且尾部会发生弯曲。若精子质膜损伤或失去生物活性，水能够自由通过质膜，在胞质内不会积聚液体，从而不会出现肿胀和尾部弯曲。等渗液等渗液低渗液精子低渗肿胀检测（HOST）进入低渗液进入等渗液膜完整精子的变化Q1:PI染色的死精子；Q4:SYBR-14染色活精子；Q2:SYBR-14/PI染色，正在死亡的精子；Q3:杂质颗粒，无颜色。精子质膜检测新方法SYBR-14和PI的联合染色显微镜进行检测A：PI染色的死精子，为红色；B：SYBR-14染色活精子，为绿色，膜功能完整；C：SYBR-14／PI染色，正在死亡的精子。流式细胞仪检测AABBCC线粒体功能检测精子线粒体检测方法检测线粒体的染料分类12检测线粒体的染料分类染料名称染色特性R123（Rhodamine123）MITO（MitoTrackerGreenFM）JC-1（5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanineiodide）1.渗透并沉积在正常线粒体上，发绿色荧光；2.若线粒体损坏则不发荧光。1.当积聚在线粒体内时会发绿色荧光。1.线粒体膜电位低时，发绿色荧光；2.膜电位高时发橙色荧光。精子线粒体检测新方法PI与JC-1联合染色流式细胞仪检测：D：多边形内的精子，为高能线粒体精子多边形外的精子，为低能线粒体；E-Q1：死精子；E-Q2：活精子高能线粒体；Q1Q2以外：为活精子低能线粒体；DE荧光显微镜检测：A：活精子高能线粒体头无色或微绿，尾橙色；B：死精子高能线粒体头红色，尾橙色；C：死精子低能线粒体头红色，尾微绿或无色。ABCJC-1单染JC-1/PI双染获能和顶体检测顶体检测获能检测精子膜的获能状态改变很容易引起顶体反应的提前发生，以及精子受精能力的丧失1.顶体反应是精子成功穿入卵母细胞所必需的过程。2.顶体内富含多种蛋白水解酶（顶体酶），在精子穿过卵子放射冠、透明带等受精过程中发挥主要作用。一二获能检测采用金霉素(CTC)CTC进入精子可以结合游离的钙离子，形成CTC-Ca2+复合物，在荧光显微镜下激发出黄绿色荧光①F型，整个精子头部有均一荧光，为未获能，顶体完整的精子；②B型，精子头前部为均一荧光，在靠近颈部部分无荧光或非常弱，为顶体完整且获能的精子；③AR型，整个精子头部无荧光，为顶体不完整的精子，即发生了顶体反应的精子。①②③顶体检测精子顶体主要是应用PI和FITC-PNA联合标记，用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。现在用的最多的是异硫氰酸荧光素（FITC）与花生凝集素（PNA）结合使用效果好。A)PI标记死精子的细胞核呈现红色荧光；B)发生顶体反应或顶体膜破损的精子被FITC-PNA标记，呈现绿色顶体。荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态A)B)流式细胞仪检测精子的活力和顶体状态Q1：PI标记为未发生顶体反应死精子；Q2：PI/FITC-PNA标记的顶体反应死精子；Q3：无颜色，未发生顶体反应活精子；Q4：FITC-PNA标记发生顶体反应活精子。体外受精检测更能够接近体内的受精过程更好的检测精子的真实质量部分动物体外受精技术并不成熟费时费力实验条件复杂成本过高优点缺点卵母细胞体外受精(IVF)技术已经很成熟，可以利用IVF技术来检测精子的受精能力。实验室评估精子质量与受精能力的关系受精能力膜IVF顶体HZA活力活力与受精能力之间具有可变的相关性。r=0.15~0.83（Kjaestadetal.,1993；Januskauskasetal.,2003）膜的完整性与受精能力之间具有显著但可变的相关性r=0.05（Almetal.,2001）；r=0.39~0.57（Januskauskas,2001）顶体与受精能力之间具有显著但可变的相关性r=0.60-0.84（WithfieldandParkinson1995；Januskauskasetal.,2000)体外受精（IVF）与受精能力之间具有显著的相关性r=0.35-0.59（Zhangetal.,1997；Schneideretal.,1999）精子与透明带的结合能力与受精能力之间具有显著的相关性r=0.50（Zhangetal.,1998）猪精液的保存处理注意事项精液稀释精液保存冷冻解冻精液运输精液稀释注意事项器具须消毒，使用前，用少量稀释液冲洗一遍品质检查不合格(活率＜0.7)的精液不能稀释精液采集后尽快稀释,原精贮存时间不宜超过30min稀释时严禁太阳光直射精液,应于较暗处操作精液要求等温稀释,以精液为标准,调节稀释液温度稀释液沿杯壁加入到精液中,沿一个方向搅拌混匀高倍稀释时先进行低倍稀释,以防“稀释打击”稀释倍数:根据精液的品质,输精量,配种母猪头数以每个输精剂量40亿/80~100ml来确定稀释倍数稀释后要求静置片刻再作精子活率检查采精量200ml,活率0.8,密度2亿/ml,每个输精剂量含40亿/100ml。总精子数=200ml×2亿/ml=400亿稀释份数=400亿×0.8/40亿=8份需稀释液=8×100ml-200ml=600ml精液保存注意事项保存要求精液需缓慢降温，室温1~2h或纱布包裹每12h将精液摇匀1次，要轻缓均匀注意冰箱内温度的变化防止温度升高或降低减少保存箱开关次数，以减少对精子的影响使用前检查活率，活率＜0.6精液应弃之用稀释液保存的精液，应尽快用完保存温度常温（17℃等）低温（4℃等）冷冻（-196℃）生产上：常温17℃精液的冷冻及解冻方法(Westendorfetal.设计，Bwangaetal改进)稀释流程冷冻流程解冻流程精液采集并进行质检用BTS稀释，降温（15℃，3h）离心（800×g，10min），弃除上清用LEY稀释，降温（5℃，2h）5℃条件下，用含甘油的LEY稀释分装于5ml扁平袋（细管）或0.5ml细管置于冷冻支架并移入程序冷