植物生理生化

1.试述研究DNA甲基化的方法2.阐述两种研究蛋白质相互作用的方法和原理3.阐述细胞信号传导的特点、基本方式及蛋白质在细胞信号传导、转化过程中分子构象发现变化的因素4.就植物本身的光合机制、外界因素的限制作用方式。从量子效率、光合作用的周转率和光能利用率这几个方面阐释植物光合潜力及提高光合作用效率的途径5.任举一例，试述如何运用基因芯片研究植物的抗逆境机制6.试述植物内NO的产生极其生理功能的研究进展一．研究DNA甲基化的方法。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。1.基于基因组整体DNA甲基化分析高效液相色谱（HPLC）法是一种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。这是一种检测DNA甲基化水平的标准方法。高效毛细管电泳法(High-performanceCapillaryElectrophoresis,HPCE)用HPCE方法处理DNA水解产物来确定5mC水平，简便，经济且敏感性高。在这两种方法的基础上，不断有新方法改进，包括，变性高效液相色谱，逆向高效液相色谱以及HPLC与薄层色谱相结合的HPLC-TLC方法。2.特异位点的甲基化分析（1）甲基敏感扩增多态性提取高质量基因组DNA，分别用EcoRI/HpaII，EcoRI/MspI两组酶组合对基因组DNA进行双酶切，并连上相应的限制性内切酶的接头，然后以接头序列设计的预扩增引物，进行PCR扩增。扩增产物稀释后，再加入带有选择性碱基的引物，进行第二次PCR扩增，扩增产物变性后在6%的序列胶上电泳，最后采用银染或同位素放射自显影方法处理序列胶，统计和分析DNA条带。（2）重亚硫酸盐处理结合测序法亚硫酸盐能使单链DNA的胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶无变化，在CpG两端设计引物，扩增出所需片段后进行直接测序，TG为非甲基化位点，CC为甲基化CG位点。从而获得CpG岛内所有的甲基化位点。二．阐述两种研究蛋白质相互作用的方法和原理1.免疫共沉淀两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来2.化学交联法通过交联剂将两个邻近的亚基或蛋白质共价偶联形成异多聚体。并利用放射自显影等技术鉴定与目的蛋白相互作用的蛋白质。3.噬菌体展示技术将编码目的蛋白的基因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一种技术。将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的噬菌体展示库。将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进行质谱鉴定。4.酵母双杂交系统真核生物细胞转录激活因子一般都含有2个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和DNA转录激活结构域(transcriptionactivationdomain，AD)。这两个结构域相互独立但功能上又相互依赖，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的活性。将拟研究的编码“猎物”蛋白的基因与AD序列结合，编码“诱饵”蛋白的基因与BD序列结合，形成两段融合基因，并在同一菌株核内表达，若“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白在核内存在相互作用，就可以重新形成完整的有活性的转录因子，从而激活报告基因的转录。因此根据报告基因的表达与否，即可判断“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白之间是否具有相互作用三．阐述细胞信号传导的特点、基本方式及蛋白质在细胞信号传导、转化过程中分子构象发现变化的因素1.细胞信号传导的特点细胞信号传导是外源化学信号分子经过多种相关成分参与的跨细胞膜的传递，最终引起细胞的应答效应。其特点是细胞内多种相关成分通过特异识别和相互作用，连续转换、传递信号所形成的的复杂级联反应。2.基本方式（1）改变细胞内各种信号传导分子的构象（2）改变信号传导分子的细胞定位（3）促进各种信号传导分子复合物的形成或降解（4）改变小分子信使的细胞内浓度或分布3.蛋白质在信号传导、转化过程中分子构象发生变化的因素（1）化学修饰改变蛋白质构象，如磷酸化与去磷酸化、乙酰化、甲基化等（2）小分子信使作为别位效应剂引起靶分子构象变化，如cAMP激活PKA（3）蛋白质相互作用克导致信号传导分子构象变化四．就植物本身的光合机制、外界因素的限制作用方式。从量子效率、光合作用的周转率和光能利用率这几个方面阐释植物光合潜力及提高光合作用效率的途径1.量子效率量子效率就是光合机构每吸收一摩尔光量子后光合释放的O2摩尔数或同化CO2摩尔数。其倒数为量子需要量。受外部因素（光照，温度，水分，O2和CO2浓度和肥料）和内部因素（光合作用，呼吸作用，叶绿素含量，NADPH/ATP比值和生长发育状况）影响；光合周转率指单位时间内光合单位进行光反应的次数；光能利用率就是光合作用贮存化学能与接受太阳能之比，前两者决定了叶片的光合速率。2．光合潜力光能潜力在植物在其外部环境因素处于最适状态时,由光能所决定的产量潜力。计算光合生产潜力就要估算光合有效辐射占总辐射的比例、作物群体截获的太阳光能的数量、光饱和点以上未被利用的能量，以及包括光呼吸消耗在内的呼吸作用所损耗的能量。另外,太阳光能通过辐射到达作物层时,一部分被反射回宇宙空间,一部分透射到土面,还有一部分被作物非光合器官所吸收。进入叶绿体光合作用反应中心的太阳光能,又受量子效率的影响，所以太阳光能最终以有机物的形式储存于植物体内的能量，只占太阳光能的极少一部分。根据量子效率理论，可计算出光合作用的最大效率为22.4%。但实际上还要排除某些因素的影响。如除去光合作用中消耗于呼吸作用的物质损失等，并以上述计算结果的30%计，则吸收的光能在光合作用中用于形成有机物质的理论有效系数当为0.224(1-0.3)=15.68%。如果再把大田反射、透射、接茬耗光和植物衰老期利用率下降等因素计算在内，则在最终形成产量的能量利用率约为10%，这一理论数值即是农业生产中有可能达到的产量上限。3.提高光合效率的途径（1）增加光能捕获合理密植,间、复、套种,减少漏光损失,改善作物的捕光性能挑〕。（2）免除环境胁迫加强田间管理,合理施肥、灌水、除草、杀虫,努力创造适于作物生长发育的优良环境。已有一些关于在空气干燥条件下喷雾增湿改善光合作用从而提高甜菜、木薯和小麦产量的报告。（3）巧用生长调节剂(包括使用植物激素)提高光合速率、延迟叶片衰老等。例如,适时适量使用NaHSO3于稻、麦和使用乙烯利于较高密度下的玉米均有一定的增产效果。（4）降低呼吸消耗作物的暗呼吸常被分为合成呼吸和维持呼吸两个部分。维持呼吸较大且可以通过选择过程来减少它。按呼吸速率低的黑麦草的净同化速率、相对生长速率和植株干物重均比暗呼吸速率高的黑麦草高。（5）减少或消除光呼吸设法改变RubisCO,使之降低或失去加氧酶活性。从而不产生光呼吸的底物磷酸乙醇酸。（6）培育优良品种（包括开发利用野生植物资源）可以采用传统的或最新的遗传工程方法。定向的改造植物。增强抗逆性，提高光合机构的效能。五．任举一例，试述如何运用基因芯片研究植物的抗逆境机制利用基因芯片研究植物在高温胁迫下的基因表达高温胁迫可诱导大量基因发生差异表达。Rizhsky等利用cDNA芯片研究烟草在高温和干旱共同胁迫下的基因表达谱，发现热激蛋白(Hsp)、活性氧中间产物消除酶、代谢相关基因和胁迫响应等4类基因同时受高温和干旱控制，另外还发现2个高温和干旱同时胁迫特异诱导的转录因子WRKY和己烯应答转录共激活子。为阐明高温胁迫对谷物灌浆期代谢的影响，Yamakawa等利用包含21938个基因的水稻芯片研究了水稻灌浆期的基因表达谱，发现淀粉合成相关基因，如淀粉粒束缚淀粉合成酶、分支酶和胞质丙酮酸、正磷酸双激酶基因在热胁迫下调表达，而α淀粉酶和热休克蛋白(Hsp)上调表达。Qin等利用基因芯片研究耐热性不同的小麦苗期叶片在高温处理下的基因表达谱，共鉴定了6560个热胁迫响应探针，这些探针所编码的基因不仅包含热激蛋白和热激转录因子，还包括其他转录因子、植物激素代谢与信号转导相关基因、RNA代谢、钙信号、核糖核酸体蛋白以及其他非生物胁迫相关基因，其中313个探针在耐热基因型和热敏感基因型间存在响应差异。Larkindale等利用基因芯片研究了拟南芥在直接高温胁迫及2种不同高温锻炼过程的基因表达谱，结果表明，在高温胁迫中，分子伴侣蛋白剧烈上调、RNA翻译、转录的抑制都可能与植物的耐热性相关。为鉴定对植物获得性耐热起作用的基因，分析了经热锻炼处理中特异响应的57个上调基因和69个下调基因，其中上调基因主要包括转录因子(HsfA3和DREB2B)、胁迫相关蛋白(热激蛋白)Hsp70、低温胁迫耐性相关蛋白kinl/COR6.6和USP)及能量代谢相关基因，下调基因主要为生物胁迫相关基因。此外，通过分析与植物耐热性相关基因启动子区域的顺式作用元件，鉴定了一些可能参与这些基因表达模式相关的基序，上调基因的元件中主要包括HSE、siteⅡ基序、DRE和ABRE，下调基因的元件主要是W-box基序。王曼玲等利用Affymetrix公司开发的水稻全基因组芯片分析了培矮64S在孕穗期和抽穗开花期高温胁迫下的叶片基因表达谱，并发掘了一些高温诱导表达基因。六．试述植物内NO的产生极其生理功能的研究进展1.植物体内NO的产生主要通过三条途径：（1）类似动物的NO合酶植物体内的类似动物的NO合酶目前还处于一种猜想阶段，在植物体内还未发现类似动物的NO合酶或其同源物。（2）硝酸还原酶硝酸还原酶途径是植物体内唯一确认能够形成NO的酶，且其是生成植物NO的主要途径，硝酸还原酶(位于胞质)通常催化硝酸还原为亚硝酸，但其大约1%的活性能是利用NADH作为还原剂进一步将亚硝酸还原为NO。还有研究表明自于植物线粒体呼吸电子传递链的电子能够驱动亚硝酸还原为NO.都可归结于以来亚硝酸的NO形成途径利用NADH或者“电子”作为还原剂，通过不同的酶催化形成NO:NO-2+e－＋2H+→NO＋H2O（3）非酶促反应在植物体内，NO也能通过非酶促机制产生:2HN02←→NO+N02+H2O←→NO+½02+H2O条件：在酸性条件下(pH5)，亚硝酸可歧化为NO和硝酸。植物体内适合NO非酶促生成的pH条件很少，但在质外体空间（抗坏血酸作为还原剂存在）等微环境中也能遇到。如在大麦糊粉层细胞，抗坏血酸作为还原剂能把亚硝酸还原为NO。2.植物体内的NO的生理功（1）打破种子的休眠，促进种子的萌发如：泡桐的种子需要长期的光照才能萌发，但经过NO的处理，一个红色脉冲就能诱导种子的萌发。因此认为NO刺激受光敏色素调节种子的萌发；在非光致发芽的小麦种子中，NO也能明显促进α一淀粉酶(α-amylase)活性的增强。（2）去黄化作用和抑制暗中生长植物下胚轴伸长NO的去黄化作用：能使在暗处生长的大麦叶片变绿、叶绿素含量增加。NO抑制暗中生长植物下胚轴伸长：能明显地抑制在暗处或弱光下生长的植物的下胚轴和节间的伸长。增加豌豆叶片叶绿素的含量，延缓病虫害侵染的马铃薯叶片叶绿素的降解.这种效应可能与NO提高植物对铁的获得有关，铁营养影响叶绿体的发育。（3）延缓果实成熟和叶片衰老已成熟果实中内源NO的含量较绿色果实和未衰老的花中低.Mishina等在拟南芥中过表达能降解NO的双加氧酶(NOD)能诱导衰老，说明NO是叶片衰老的负调节因子，过程与NO和乙烯的相互作用有关。（4）参与植物开花信号传导NO参与植物开花信号传导途径，例如，调节拟南芥由营养生长向生殖生长的转变。NO可抑制CONSTANS(CO)和GIGANTEA(GI)基因的表达，而增强FLOWERINGLOCUSC(FLC)基因的表达，通过调节光周期来调控植物的开花时间。由于NO可来源于环境和植物内部，因此可通过外部和内部两个途径来控制植物的开花时间（5）诱导不定根的形成与